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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】低GC含量的模板设计引物
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】低GC含量的模板设计引物 已有6人参与

本人最近要做一个基因的互补，用CDNA为模板区扩增该基因的CDS，但是设计的引物一直扩不出来，我不停的更换引物，加大长度，提高TM值等，但是没有收到有效的结果，扩增的特意性很差。后来我发现我的模板的GC含量比较低，不到30%。设计引物的TM值也不高，我尝试在酶切微点的额保护碱基处多加几个GC，也不行。对于GC含量低的模板，大家有什么好方法得到比较特异的扩增吗？
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1楼 2010-05-04 20:13:42
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虫子火箭兵

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-05 15:36:47
加保护碱基一般来说是不行的，因为在扩增的时候 保护碱基是不会与模板结合的，这样你的Tm值还是不会提高，把退火温度做个梯度，适当的调高一下看看
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2楼2010-05-05 08:19:03
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stliimoon

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
同意楼上意见，先做一下温度梯度，确定一下比较好的退火温度，要不你做个TD PCR看一下，这样可能效率比较高
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3楼2010-05-05 08:34:20
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
具体怎么做梯度？是不是把相近的温度挨个试试？什么是TD pcr？
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4楼2010-05-05 14:36:58
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love_st

金虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引物长度适当的增加看看，综合考虑，我想没有那么难的
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5楼2010-05-05 14:53:07
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
加引物长度了撒。这是最具性价比的方法
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6楼2010-05-05 14:54:52
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by plantst5928 at 2010-05-05 14:36:58:
具体怎么做梯度？是不是把相近的温度挨个试试？什么是TD pcr？

touch-down pcr
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7楼2010-05-05 15:49:02
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
我已经把引物长度加长到了40bp，还是没有扩增出来啊。
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8楼2010-05-05 18:39:36
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