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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[求助] Touch Down PCR 已有6人参与

各位亲，谁做过Touch Down PCR 啊？我用做普通PCR的体系，做普通PCR，能做出好多杂带，但是用Touch Down PCR，却一条带都没有，我用的程序是，高于TM值10的温度开始每个循环降低一度，到TM-5，最低退火温度的时候，再做20个循环，这样就相当于总共做了35个循环，最后再72度延伸10分钟，但是却一条条带都没有，哪位亲，帮忙分析一下
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1楼 2013-12-24 14:13:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hoajie

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-24 21:35:29
我做过touch down，不过跟你的不一样哎，不知道是不是pcr仪不一样。我们实验室的pcr仪是8列的，做touchdown时用8个样品，每一列各一个样品，从A到H，温度逐渐降低。你只要输入最大温度和最低温度，就行了。效果还好啊，高温时扩出来了，低温时有非特异性条带。
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2楼2013-12-24 18:07:12
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woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-24 21:35:40
能出来的
1、看看扩增片段的GC含量是否偏高；
2、如果不高，做TD-PCR的时候，可以考虑三个温度就可以了。不用每个循环降温，容易出弥散；
3、有问题联系
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3楼2013-12-24 18:12:37
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woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by hoajie at 2013-12-24 18:07:12
我做过touch down，不过跟你的不一样哎，不知道是不是pcr仪不一样。我们实验室的pcr仪是8列的，做touchdown时用8个样品，每一列各一个样品，从A到H，温度逐渐降低。你只要输入最大温度和最低温度，就行了。效果还好 ...

你说的是梯度PCR，不是TD-PCR
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4楼2013-12-24 18:12:57
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overhalfmoon

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-24 21:36:08
我一般不会每个循环降低一度，我都是每循环将0.3度，不需要降到TM-5度，这样特异性会非常差

另外P不出条带请找阳性对照试试看，看看是不是酶、模板等的问题
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5楼2013-12-24 21:05:23
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hoajie at 2013-12-24 18:07:12
我做过touch down，不过跟你的不一样哎，不知道是不是pcr仪不一样。我们实验室的pcr仪是8列的，做touchdown时用8个样品，每一列各一个样品，从A到H，温度逐渐降低。你只要输入最大温度和最低温度，就行了。效果还好 ...

亲 你说的这个是梯度PCR吧
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6楼2013-12-25 16:05:47
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by woshishui916 at 2013-12-24 18:12:37
能出来的
1、看看扩增片段的GC含量是否偏高；
2、如果不高，做TD-PCR的时候，可以考虑三个温度就可以了。不用每个循环降温，容易出弥散；
3、有问题联系

请问体系里各种试剂是怎么加呢  跟做普通PCR是一样的吗
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7楼2013-12-25 16:06:34
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by overhalfmoon at 2013-12-24 21:05:23
我一般不会每个循环降低一度，我都是每循环将0.3度，不需要降到TM-5度，这样特异性会非常差

另外P不出条带请找阳性对照试试看，看看是不是酶、模板等的问题

阳性对照是不加模板或者是酶吗
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8楼2013-12-25 16:07:21
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woshishui916

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-25 16:06:34
请问体系里各种试剂是怎么加呢  跟做普通PCR是一样的吗...

是的
不过加了点保护剂
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9楼2013-12-25 16:28:08
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海豚湾小鱼

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-29 16:19:03
建议做完一次Touch down后，再做一次二次pcr。
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10楼2013-12-26 09:29:07
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