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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[求助] Touch Down PCR已有6人参与

各位亲,谁做过Touch Down PCR 啊?我用做普通PCR的体系,做普通PCR,能做出好多杂带,但是用Touch Down PCR,却一条带都没有,我用的程序是,高于TM值10的温度开始每个循环降低一度,到TM-5,最低退火温度的时候,再做20个循环,这样就相当于总共做了35个循环,最后再72度延伸10分钟,但是却一条条带都没有,哪位亲,帮忙分析一下
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hoajie

银虫 (初入文坛)

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★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-24 21:35:29
我做过touch down,不过跟你的不一样哎,不知道是不是pcr仪不一样。我们实验室的pcr仪是8列的,做touchdown时用8个样品,每一列各一个样品,从A到H,温度逐渐降低。你只要输入最大温度和最低温度,就行了。效果还好啊,高温时扩出来了,低温时有非特异性条带。
2楼2013-12-24 18:07:12
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woshishui916

木虫 (著名写手)

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★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-24 21:35:40
能出来的
1、看看扩增片段的GC含量是否偏高;
2、如果不高,做TD-PCR的时候,可以考虑三个温度就可以了。不用每个循环降温,容易出弥散;
3、有问题联系
3楼2013-12-24 18:12:37
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普通回帖

woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by hoajie at 2013-12-24 18:07:12
我做过touch down,不过跟你的不一样哎,不知道是不是pcr仪不一样。我们实验室的pcr仪是8列的,做touchdown时用8个样品,每一列各一个样品,从A到H,温度逐渐降低。你只要输入最大温度和最低温度,就行了。效果还好 ...

你说的是梯度PCR,不是TD-PCR
4楼2013-12-24 18:12:57
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overhalfmoon

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-24 21:36:08
我一般不会每个循环降低一度,我都是每循环将0.3度,不需要降到TM-5度,这样特异性会非常差

另外P不出条带请找阳性对照试试看,看看是不是酶、模板等的问题
5楼2013-12-24 21:05:23
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hoajie at 2013-12-24 18:07:12
我做过touch down,不过跟你的不一样哎,不知道是不是pcr仪不一样。我们实验室的pcr仪是8列的,做touchdown时用8个样品,每一列各一个样品,从A到H,温度逐渐降低。你只要输入最大温度和最低温度,就行了。效果还好 ...

亲 你说的这个是梯度PCR吧
6楼2013-12-25 16:05:47
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by woshishui916 at 2013-12-24 18:12:37
能出来的
1、看看扩增片段的GC含量是否偏高;
2、如果不高,做TD-PCR的时候,可以考虑三个温度就可以了。不用每个循环降温,容易出弥散;
3、有问题联系

请问体系里各种试剂是怎么加呢  跟做普通PCR是一样的吗
7楼2013-12-25 16:06:34
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by overhalfmoon at 2013-12-24 21:05:23
我一般不会每个循环降低一度,我都是每循环将0.3度,不需要降到TM-5度,这样特异性会非常差

另外P不出条带请找阳性对照试试看,看看是不是酶、模板等的问题

阳性对照是不加模板或者是酶吗
8楼2013-12-25 16:07:21
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woshishui916

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-25 16:06:34
请问体系里各种试剂是怎么加呢  跟做普通PCR是一样的吗...

是的
不过加了点保护剂
9楼2013-12-25 16:28:08
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海豚湾小鱼

新虫 (初入文坛)

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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2014-01-29 16:19:03
建议做完一次Touch down后,再做一次二次pcr。
10楼2013-12-26 09:29:07
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