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uuu555000

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[交流] 巢氏PCR引物如何设计？

如题，巢氏PCR引物如何设计
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1楼 2012-06-12 17:25:08
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西瓜

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10楼: Originally posted by 蓝慧 at 2012-06-13 17:19:39
请教，巢式PCR的目的是什么？...

主要是增加特异性。可以参考百度百科：

　　巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。
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11楼2012-06-13 18:39:41
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西瓜

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amisking: 金币+3, 辛苦，鼓励下。 2012-06-12 18:17:55
uuu555000: 金币+1 2012-06-12 18:21:38
巢式PCR就是2轮PCR,第二次PCR以第一次PCR的产物为模板。第二对引物设计上比第一对里面更靠里，就是说第二次PCR的产物比第一次的产物要短一些。至于短多少，至少两端各往里几个bp。其他就和普通PCR没什么特别的啦。
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2楼2012-06-12 17:53:17
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uuu555000

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2楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-06-12 17:53:17
巢式PCR就是2轮PCR,第二次PCR以第一次PCR的产物为模板。第二对引物设计上比第一对里面更靠里，就是说第二次PCR的产物比第一次的产物要短一些。至于短多少，至少两端各往里几个bp。其他就和普通PCR没什么特别的啦。

还能第一次PCR产物，第一次的引物，还能pcr？
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3楼2012-06-12 18:21:30
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西瓜

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小丹木木: 金币+2, 辛苦了 2012-06-13 13:36:34
引用回帖:
3楼: Originally posted by uuu555000 at 2012-06-12 18:21:30
还能第一次PCR产物，第一次的引物，还能pcr？...

第一次的引物再用，效果不好，酶需要一些额外片段来结合在模板上，所以第二对引物要靠里。引物不同，能增加特异性，这也是巢式PCR的意义所在啦。你可以百度一下原理，看到图片会更好理解哈
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4楼2012-06-12 18:24:09
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uuu555000

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4楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-06-12 18:24:09
第一次的引物再用，效果不好，酶需要一些额外片段来结合在模板上，所以第二对引物要靠里。引物不同，能增加特异性，这也是巢式PCR的意义所在啦。你可以百度一下原理，看到图片会更好理解哈...

第一次的PCR产物不稀释能直接作为第2轮的模板？
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5楼2012-06-12 18:49:40
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西瓜

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uuu555000: 金币+9 2012-06-12 19:13:04
引用回帖:
5楼: Originally posted by uuu555000 at 2012-06-12 18:49:40
第一次的PCR产物不稀释能直接作为第2轮的模板？...

可以的，就是要这么做
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6楼2012-06-12 19:01:03
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uuu555000

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6楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-06-12 19:01:03
可以的，就是要这么做...

第1轮的产物不割胶回收，能直接上PCR？
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7楼2012-06-12 19:12:59
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证明题

金虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by uuu555000 at 2012-06-12 19:12:59
第1轮的产物不割胶回收，能直接上PCR？...

可以的，就是要求要内里的巢式引物与第一轮的外部引物不同，这样即使不割胶回收第一次PCR产物，也能保证其特异性和扩增效率。
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8楼2012-06-12 20:42:43
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西瓜

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7楼: Originally posted by uuu555000 at 2012-06-12 19:12:59
第1轮的产物不割胶回收，能直接上PCR？...

楼上正解啦
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9楼2012-06-12 21:06:54
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蓝慧

木虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-06-12 18:53:17
巢式PCR就是2轮PCR,第二次PCR以第一次PCR的产物为模板。第二对引物设计上比第一对里面更靠里，就是说第二次PCR的产物比第一次的产物要短一些。至于短多少，至少两端各往里几个bp。其他就和普通PCR没什么特别的啦。

请教，巢式PCR的目的是什么？
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10楼2012-06-13 17:19:39
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lwy3511

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by 证明题 at 2012-06-12 20:42:43
可以的，就是要求要内里的巢式引物与第一轮的外部引物不同，这样即使不割胶回收第一次PCR产物，也能保证其特异性和扩增效率。...

那请问如果第一轮P完跑胶看不到条带，P第二轮还有意义吗？同时发现用第二轮引物可以一次直接P出来，那这样是否就不需要前面第一轮简并引物去P了？
求指教。我是分子生物学菜鸟
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12楼2016-03-16 09:34:47
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