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惊叹号

金虫 (正式写手)

[求助] 怎么优化PCR体系已有2人参与

目的片段:1200bp
反应体系:cDNA:1ug    引物浓度:250nmol/l      氯化镁:1.5mmol/l       Taq酶:0.5U      dNTP:200umol/l
循环体系:95℃,5min;        95℃,30s;          44℃~52℃:30s;        72℃:1min30s
引物给出的Tm值最小为49℃,我58℃、60℃都跑过,但是结果都是只有引物二聚体。
引物为师兄帮忙设计,老板说没问题,上下游引物中都含有TTAATTAA酶切位点。
请教各位高手,体系还需要怎么优化?
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hihe99

银虫 (小有名气)

引用回帖:
20楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-03 23:00:05
我的一个基因扩全长,引物不好,一直扩不出来,有发夹结构,温度梯度,模板量,touch down都试了,没有目的条带,只有引物二聚体,明天按你的跑一下,试试...

我感觉两步法还是要引物TM值高些才能有效,
你的模版检测过没,有没有问题?
22楼2014-11-04 11:49:30
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synbio

新虫 (初入文坛)

试一下47℃退火。
4楼2014-10-31 14:15:16
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
惊叹号: 金币+20, 有帮助 2014-10-31 22:03:41
cDNA1ug吗?还是1ul,1ul太多了,20ng就可以p出来了,你的时间可以设一个梯度,从45左右到60
踏实
5楼2014-10-31 20:08:31
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惊叹号

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by synbio at 2014-10-31 14:15:16
试一下47℃退火。

我用梯度PCR44℃、46℃、48℃、50℃、52℃,包括58℃、60℃我都试过了,而且有一个问题就是,温度越高,感觉引物二聚体越明显。
6楼2014-10-31 22:02:45
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