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惊叹号

金虫 (正式写手)

[求助] 怎么优化PCR体系 已有2人参与

目的片段:1200bp
反应体系:cDNA:1ug    引物浓度:250nmol/l      氯化镁:1.5mmol/l       Taq酶:0.5U      dNTP:200umol/l
循环体系:95℃,5min;        95℃,30s;          44℃~52℃:30s;        72℃:1min30s
引物给出的Tm值最小为49℃,我58℃、60℃都跑过,但是结果都是只有引物二聚体。
引物为师兄帮忙设计,老板说没问题,上下游引物中都含有TTAATTAA酶切位点。
请教各位高手,体系还需要怎么优化?
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厚德求是

木虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
内容已删除
2楼2014-10-31 13:38:11
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本帖仅楼主可见
3楼2014-10-31 13:47:34
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synbio

新虫 (初入文坛)

试一下47℃退火。
4楼2014-10-31 14:15:16
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
惊叹号: 金币+20, 有帮助 2014-10-31 22:03:41
cDNA1ug吗?还是1ul,1ul太多了,20ng就可以p出来了,你的时间可以设一个梯度,从45左右到60
踏实
5楼2014-10-31 20:08:31
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惊叹号

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by synbio at 2014-10-31 14:15:16
试一下47℃退火。

我用梯度PCR44℃、46℃、48℃、50℃、52℃,包括58℃、60℃我都试过了,而且有一个问题就是,温度越高,感觉引物二聚体越明显。
6楼2014-10-31 22:02:45
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惊叹号

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hajierlove at 2014-10-31 20:08:31
cDNA1ug吗?还是1ul,1ul太多了,20ng就可以p出来了,你的时间可以设一个梯度,从45左右到60

cDNA在0.1-2ug之间应该都是没问题的,梯度我设过了,从44℃到52℃,包括58℃、60℃都设过。
7楼2014-10-31 22:05:08
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与,应助指数 +1
惊叹号: 金币+20, 有帮助, 184484345 2014-11-01 08:49:20
惊叹号: 金币+280, ★★★★★最佳答案, 非常感谢 2014-11-01 10:50:05
你这个很难说哪里没问题,留下QQ聊吧,我帮你分析下。

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-10-31 22:31:12
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)

引物Tm值太低了吧,降低退火温度,还有buffer 和镁离子分开的话,调节一下镁离子浓度,我们以前的实验就是受镁离子农奴度影响的,其他的我也暂时没想到

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

9楼2014-11-01 11:34:10
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惊叹号

金虫 (正式写手)

送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 刘芬玲 at 2014-11-01 11:34:10
引物Tm值太低了吧,降低退火温度,还有buffer 和镁离子分开的话,调节一下镁离子浓度,我们以前的实验就是受镁离子农奴度影响的,其他的我也暂时没想到

我做过阳性对照,很清晰的一条带,所以镁离子浓度是没问题的。
10楼2014-11-01 15:50:51
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