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惊叹号

金虫 (正式写手)

[求助] 怎么优化PCR体系 已有2人参与

目的片段:1200bp
反应体系:cDNA:1ug    引物浓度:250nmol/l      氯化镁:1.5mmol/l       Taq酶:0.5U      dNTP:200umol/l
循环体系:95℃,5min;        95℃,30s;          44℃~52℃:30s;        72℃:1min30s
引物给出的Tm值最小为49℃,我58℃、60℃都跑过,但是结果都是只有引物二聚体。
引物为师兄帮忙设计,老板说没问题,上下游引物中都含有TTAATTAA酶切位点。
请教各位高手,体系还需要怎么优化?
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)

引物Tm值太低了吧,降低退火温度,还有buffer 和镁离子分开的话,调节一下镁离子浓度,我们以前的实验就是受镁离子农奴度影响的,其他的我也暂时没想到

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9楼2014-11-01 11:34:10
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
14楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-03 10:43:50
不分开的话怎么调节...

没有分开就按buffer的量加入就好了,一般问题不大
18楼2014-11-03 17:20:44
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