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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构重组质粒老是构不出来 请高手赐教
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西柚

银虫 (初入文坛)

[求助] 构重组质粒老是构不出来 请高手赐教已有4人参与

本人构重组质粒有一段时间了。有一个质粒一直构不出来。外源目的片段有500bp,从跑胶上看是我的目的片段。用的载体是pGL3-promoter ,酶切位点是 xho1和kpn1,从跑胶来看，比原始的质粒跑慢了很多，质粒是已经切开了的。
酶切反应：  Buffer: 5ul     PCR product/ pGL3-promoter  5000ng     kpn1 5ul    xho1 5ul    水补足到50ul。 酶切后的 pGL3-promoter进行sap处理 。跑胶回收后酶连过夜。酶连时，外源目的片段与载体的摩尔比是4：1。
用的酶都是泰克拉的。但是挑的单克隆都是空载体   做了不下五次 ，扩目的片段的引物也重新设计过一次。
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1楼2014-10-26 11:52:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-26 18:10:01
西柚: 金币+2 2014-10-29 19:56:09
kpn1 5ul    xho1 5ul    水补足到50ul

你的酶加的太多了
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3楼2014-10-26 16:31:57
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普通回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-26 18:09:52
西柚: 金币+4, ★有帮助 2014-10-29 19:52:20
酶切反应中酶加的太多了吧，会不会是产生了星号活性。优化下酶切过程吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-10-26 16:05:49
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西柚

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-10-26 16:05:49
酶切反应中酶加的太多了吧，会不会是产生了星号活性。优化下酶切过程吧。

应该加多少呢  
降到2ul 可以吗  
我是按照说明说上来的
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4楼2014-10-29 19:54:36
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西柚

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-10-26 16:31:57
kpn1 5ul    xho1 5ul    水补足到50ul

你的酶加的太多了

我是按照说明书上加的   我试试减少酶量
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5楼2014-10-29 19:55:52
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 西柚 at 2014-10-29 19:54:36
应该加多少呢  
降到2ul 可以吗  
我是按照说明说上来的...

0.5或者1微升每100微升体系。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2014-10-29 20:06:53
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)
★
西柚(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-30 19:13:41
引用回帖:
4楼: Originally posted by 西柚 at 2014-10-29 19:54:36
应该加多少呢  
降到2ul 可以吗  
我是按照说明说上来的...

酶的体积不能超过总体积的1/10

每个加2ul可以。
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7楼2014-10-30 18:33:19
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

酶的确太多了，但是这应该不是主要原因吧···
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···
8楼2014-10-30 20:36:26
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hongqifei

木虫 (小有名气)
载体也加太多了，不需要5ug那么多，1~2ug就够了
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
9楼2014-10-30 21:48:04
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飓飙小子

金虫 (正式写手)
做出来了吗？我现在也是这两个酶切位点，也是得到空载体。想问问你找出原因了吗？
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说好的一起白头到老，你却偷偷焗了油。。。
10楼2014-11-17 20:57:15
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