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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 怎么老是连接失败？
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wncgliu86

金虫 (正式写手)

[求助] 怎么老是连接失败？ 已有7人参与

我用Eco EI和Not I双酶切约为460 bp的片段和pPICZA和pGAPZA，然后用T4连接酶，无论16度过夜还是常温1小时，都一直连接不上，切胶回收跑电泳有条带，是哪儿出问题了呢？谢谢大家
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1楼 2014-05-19 07:20:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

猪尾巴草

新虫 (小有名气)

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-19 12:57:14
wncgliu86: 金币+1 2014-05-20 09:34:33
16度过夜？这么高，我一般是4度过夜，16度5小时
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2楼2014-05-19 09:03:20
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-19 12:57:20
wncgliu86: 金币+1 2014-05-20 09:33:45
可以尝试改变一下连接体系中载体和目的基因的比例，此外，选用转化效率较高的感受态来进行转化
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
3楼2014-05-19 09:59:39
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Neo2000

木虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-05-19 20:10:37
你用哪家的酶呢？

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4楼2014-05-19 10:02:32
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BioChen

银虫 (正式写手)

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-19 12:57:33
wncgliu86: 金币+1 2014-05-20 09:33:59
作为新手，要多看技术文档。像连接失败，PCR不成功，酶切失败等问题，我没有办法给你具体的指导。
告诉你一个原则，“实验结果阴性，看阳性对照”。祝你实验成功。
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5楼2014-05-19 11:20:52
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dongge2013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-05-19 12:57:46
你460bp的片段是从哪切出来的？构建的克隆载体还是PCR产物
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6楼2014-05-19 11:51:37
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)

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★ ★ ★
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wncgliu86: 金币+3 2014-05-20 09:34:20
你参考下：、
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=5796216&fpage=1
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懒病又犯了……
7楼2014-05-19 14:49:33
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wncgliu86

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-19 10:02:32
你用哪家的酶呢？

NEB
8楼2014-05-20 09:32:04
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wncgliu86

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dongge2013 at 2014-05-19 11:51:37
你460bp的片段是从哪切出来的？构建的克隆载体还是PCR产物

PCR产物双酶切后回收
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9楼2014-05-20 09:33:23
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Neo2000

木虫 (著名写手)

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9楼: Originally posted by wncgliu86 at 2014-05-20 09:33:23
PCR产物双酶切后回收...

你何不PCR产物ta下，测序对了再切

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10楼2014-05-20 10:18:36
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