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20083630zhan

木虫 (正式写手)


[交流] 连接转化交流贴

大家把自己连接转化遇到的困难以及经验写下来吧,
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sunnyboylg

木虫 (正式写手)


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20083630zhan(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:00
这几天做质粒转化,一直没长出菌来,我想想估计是质粒酶切跑电泳切胶回收浓度太低了,都没有多少质粒转进去,而且感受态细胞浓度也不够高。总之都是浓度低惹的祸
2楼2013-05-15 22:17:56
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yiloutingyu

铜虫 (小有名气)


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20083630zhan(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:08
已经做了一个月了,还是没做出来,一直涂板长不出来,后来找到原因,是大肠杆菌的原因,换了 做场感受态之后,能长出来,挑单菌落后摇不起来。就这样耗着,前面都没问题,我也各种验证,现在在怀疑我的感受态试剂盒。连接以前是在16度 水浴过夜,现在换成4度冰箱里冰浴过夜,效果好一些。在转化的过程中,最好是42度 热击90秒。
4楼2013-05-15 23:22:07
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光树林

木虫 (著名写手)


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20083630zhan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-05-19 18:16:31
回收浓度确实有一定的影响,主要是最好16度多连接一会儿,过夜挺好的
5楼2013-05-16 00:00:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


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20083630zhan(myprayer代发): 金币+1, 感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:17
有时候感受态细胞不是特别理想。自己制备的感受态用氨苄的抗性板有时候负对照会长克隆。
6楼2013-05-16 06:45:36
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20083630zhan

木虫 (正式写手)


我的也是,最近一段时间做转化,菌P时候有条带,但是培养之后提取质粒后酶切,没有目的条带。做了几次都是这样,感觉应该是转化除了什么问题
7楼2013-05-16 08:27:21
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shenmh_1987

新虫 (初入文坛)


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20083630zhan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-19 18:16:50
1.感受态质量要有保障,实在不行就用商业化的感受态,免得在连接转化这种小问题上纠结好久
2.连接时片段载体比例要适中
3.转化过程中不能让感受态受热,热激时间根据感受态不同严格把握
4.热激后迅速放于冰上,且避免震动。
8楼2013-05-18 19:57:19
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20083630zhan

木虫 (正式写手)


个人觉得电转化的效率比化学转化的效率高出许多,并且,操作还简单
10楼2013-05-19 09:34:27
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莓林塔

木虫 (小有名气)


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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-19 18:17:09
引用回帖:
10楼: Originally posted by 20083630zhan at 2013-05-19 09:34:27
个人觉得电转化的效率比化学转化的效率高出许多,并且,操作还简单

TA连接的体系本身就是高离子浓度的,不适宜用电转啊,电转转个质粒啥的还是不错的。。而且我昨天也电转了,还是没长!!!好讨厌啊,还没找到原因。。。
11楼2013-05-19 14:43:11
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莓林塔

木虫 (小有名气)


我的现在就出鬼了一样,我老师现在只能安慰我说,会做出来的,总会做出来的继续找原因吧,哎
12楼2013-05-19 14:45:03
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20083630zhan

木虫 (正式写手)


引用回帖:
11楼: Originally posted by 莓林塔 at 2013-05-19 14:43:11
TA连接的体系本身就是高离子浓度的,不适宜用电转啊,电转转个质粒啥的还是不错的。。而且我昨天也电转了,还是没长!!!好讨厌啊,还没找到原因。。。...

我用的载体是PUC19,感觉电转化效率比化学方法好,但是,最近挑单菌落PCR偶条带,提取质粒酶切总是没有条带,好桑心啊
13楼2013-05-20 11:17:46
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hanyueV5

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by yiloutingyu at 2013-05-15 23:22:07
已经做了一个月了,还是没做出来,一直涂板长不出来,后来找到原因,是大肠杆菌的原因,换了 做场感受态之后,能长出来,挑单菌落后摇不起来。就这样耗着,前面都没问题,我也各种验证,现在在怀疑我的感受态试剂盒 ...

我的也是,前面都没问题,就是转化的单菌落摇不起来,要不就是出现大量的空载体,甚至是连载体都没有的假阳性,而且我的还是两个不同的实验,不同的材料····这到底是什么原因什么原因,我严重怀疑是转化出问题了,可这都是实验室的老方法,以前都ok的啊
14楼2013-05-20 13:18:39
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yiloutingyu

铜虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by hanyueV5 at 2013-05-20 13:18:39
我的也是,前面都没问题,就是转化的单菌落摇不起来,要不就是出现大量的空载体,甚至是连载体都没有的假阳性,而且我的还是两个不同的实验,不同的材料····这到底是什么原因什么原因,我严重怀疑是转化出问题 ...

我今天刚用氯化钙法重新做了感受态,已经转化了,看明天的结果吧。
15楼2013-05-20 20:25:18
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2013-05-15 22:48   回复  
wandsy9楼
2013-05-18 21:32   回复  
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