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[交流]
连接！转化！出问题了！！！！
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我做的连接转化，后提质粒，利用T载体鉴定试剂盒检测，如图。 目的基因大约是2000bp，连接载体是Promoge载体pGEM-T载体，转化菌株是JM109菌种 连接后，冻融法转化JM109，涂Amp，IPTG, X-gal 平板。 问题1. 出现了，平板全是白斑没有蓝斑！！（Promoge载体自连很严重，但却没有了，而且前段时间是有蓝白斑的，就在这一个月没有蓝斑只有白斑，不但我的实验是这样，整个实验室全是白斑，没有蓝斑） 问题2. 我提质粒显示确是1500的条带（载体大约3000bp），目的基因PCR检测是空白，证明是空载体！！用T载体鉴定试剂盒检测（SP6/T7引物检测）的确是空载体（250bp左右），也同样可以排除1500是细菌基因组DNA的可能性。 求解！！！    212.jpg |
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火舞精灵3: 金币+5 2012-12-29 08:53:02
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1：看电泳，你提出来的质粒大小根本不对，3000的质粒+2000的目的条带，根据经验，环形质粒跑出来差不多在3000多点的位置，猜测你提出来的这个是大肠杆菌的基因组碎片. 2：你用了一对T载体上的引物做了一个质粒PCR？是吧.其实PCR这个东西用来作验证是非常不可靠的，可还是很多人喜欢用这个方法，前几天我一师弟做了16管PCR验证，结果非常漂亮，但是提质粒酶切了，全是假阳性.既然你都提质粒了，何不直接单酶切一下，简单准确. 3：蓝白斑，这个已经被我们实验室抛弃很久的方法了，一直用的TAKARA的pMD19-T配合它们家的DH5α，阳性率很可观，随便挑几个菌落基本9成是阳性. PS:好运. |
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