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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接！转化！出问题了！！！！
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

[交流] 连接！转化！出问题了！！！！

我做的连接转化，后提质粒，利用T载体鉴定试剂盒检测，如图。
   目的基因大约是2000bp，连接载体是Promoge载体pGEM-T载体，转化菌株是JM109菌种
连接后，冻融法转化JM109，涂Amp，IPTG, X-gal 平板。
    问题1.    出现了，平板全是白斑没有蓝斑！！（Promoge载体自连很严重，但却没有了，而且前段时间是有蓝白斑的，就在这一个月没有蓝斑只有白斑，不但我的实验是这样，整个实验室全是白斑，没有蓝斑）

    问题2.    我提质粒显示确是1500的条带（载体大约3000bp），目的基因PCR检测是空白，证明是空载体！！用T载体鉴定试剂盒检测（SP6/T7引物检测）的确是空载体（250bp左右），也同样可以排除1500是细菌基因组DNA的可能性。
   
    求解！！！

212.jpg
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1楼 2012-12-19 13:15:28
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笑笑天涯

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-19 17:26:14
左边的Marker是lamda Hind3?
这个质粒看着很大啊,为什么不拿酶单切下呢?
2kb稍稍有点大,但是还是连得上的,但是连接效率会低一点
连接不上的可能能也有,还要看连接酶效率
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2楼2012-12-19 15:05:09
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普通回帖

火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 笑笑天涯 at 2012-12-19 15:05:09
左边的Marker是lamda Hind3?
这个质粒看着很大啊,为什么不拿酶单切下呢?
2kb稍稍有点大,但是还是连得上的,但是连接效率会低一点
连接不上的可能能也有,还要看连接酶效率

左边Marker是LD15000
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3楼2012-12-19 15:51:49
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望海思月

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是你们实验室IPTG, X-gal出问题了，检测不出来，恰好你挑的那几个转化子是空连的
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4楼2012-12-19 16:21:19
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 望海思月 at 2012-12-19 16:21:19
是不是你们实验室IPTG, X-gal出问题了，检测不出来，恰好你挑的那几个转化子是空连的

这个？？
的确IPTG和X-gal是很久了，最近还配不了新的过滤膜没了
        那质粒为什么会在15000bp左右呢？
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5楼2012-12-19 16:25:16
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望海思月

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+1, maybe 2013-01-25 07:17:00
引用回帖:
5楼: Originally posted by 火舞精灵3 at 2012-12-19 16:25:16
这个？？
的确IPTG和X-gal是很久了，最近还配不了新的过滤膜没了
        那质粒为什么会在15000bp左右呢？...

我怀疑你提出来的根本不是质粒，15000bp有可能是断掉的染色体片段
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6楼2012-12-19 16:58:04
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望海思月

铜虫 (小有名气)
我怀疑你提出来的根本不是质粒，15000bp有可能是断掉的染色体片段
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7楼2012-12-19 16:58:21
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1949stone: 金币+1, 很好的意见 2013-01-25 07:16:29
我也觉得你提取的质粒根本不是质粒，大小差异不会那么大，而且条带很不清晰。而质粒丢失可能是Amp失活。
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8楼2012-12-19 17:09:36
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 望海思月 at 2012-12-19 16:58:21
我怀疑你提出来的根本不是质粒，15000bp有可能是断掉的染色体片段

那为什么T7/SP6会有条带？
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9楼2012-12-19 17:33:30
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-19 17:09:36
我也觉得你提取的质粒根本不是质粒，大小差异不会那么大，而且条带很不清晰。而质粒丢失可能是Amp失活。

那为什么T7/SP6会有条带？
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10楼2012-12-19 17:33:38
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望海思月

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by 火舞精灵3 at 2012-12-19 17:33:30
那为什么T7/SP6会有条带？...

没用过T载体鉴定试剂盒，不知道你说的250bp的条带是什么。而且看图上的小条带都有点像引物二聚体啊
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11楼2012-12-19 18:04:46
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liguanying

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
蓝白斑问题，4楼已经说了。关于，1500bp条带，确实是空载体，因为它是环状或超螺旋的，所以不可用线状的标准去衡量。另外，楼主做的胶也有问题啊，跑出来的图太丑了，建议下次做胶时，融化后，对光看一下，确定里面没有颗粒了，再进行灌胶，如果有颗粒，多摇动一下或者多煮沸一会，至到没有琼脂糖颗粒存在。
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12楼2012-12-19 18:31:44
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笑笑天涯

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这样检定T载体连接产物,我也从来没用过,单纯地菌落PCRye是做过的,但也只求快,这样的PCR方式,要抽质粒不说,还要PCR,你的第一环已经出问题了,怎么能相信第二环的结果呢?
既然有质粒,就直接拿质粒做酶切验证下,有什么问题一目了然,电泳也好,PCR也好,都有欺骗人的可能.超螺旋的质粒,没有线性化的直观好辩.
不知道这样说,你能明白吗?
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13楼2012-12-20 09:04:22
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笑笑天涯

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还有蓝白筛选,这简直是可有可无的东西,万一IPTG,X-GAL加不对了,就出了假象了.
再有,抽质粒,即便都拿试剂盒来抽,不同的人抽的效果也不同,特别新手,拿捏不准那个节奏,得到的不是多带就是怪模怪样.
这些都是分子实验里小得不能再小的基础问题,只有多做让自己熟能生巧.
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14楼2012-12-20 09:08:24
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 望海思月 at 2012-12-19 18:04:46
没用过T载体鉴定试剂盒，不知道你说的250bp的条带是什么。而且看图上的小条带都有点像引物二聚体啊...

T载体的切口两侧有一对引物，分别是SP6引物和T7引物
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15楼2012-12-20 10:06:31
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
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12楼: Originally posted by liguanying at 2012-12-19 18:31:44
蓝白斑问题，4楼已经说了。关于，1500bp条带，确实是空载体，因为它是环状或超螺旋的，所以不可用线状的标准去衡量。另外，楼主做的胶也有问题啊，跑出来的图太丑了，建议下次做胶时，融化后，对光看一下，确定里面 ...

那如果是环状或是超螺旋，应该比线性的小，总共加起来也不过6000bp
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16楼2012-12-20 10:56:31
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 笑笑天涯 at 2012-12-20 09:04:22
这样检定T载体连接产物,我也从来没用过,单纯地菌落PCRye是做过的,但也只求快,这样的PCR方式,要抽质粒不说,还要PCR,你的第一环已经出问题了,怎么能相信第二环的结果呢?
既然有质粒,就直接拿质粒做酶切验证下,有什么 ...

嗯，谢谢了，整套药品再重新配
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17楼2012-12-20 11:02:46
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 笑笑天涯 at 2012-12-20 09:08:24
还有蓝白筛选,这简直是可有可无的东西,万一IPTG,X-GAL加不对了,就出了假象了.
再有,抽质粒,即便都拿试剂盒来抽,不同的人抽的效果也不同,特别新手,拿捏不准那个节奏,得到的不是多带就是怪模怪样.
这些都是分子实验 ...

好的，一定记住这些小问题。
药品今天重配一下了
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18楼2012-12-20 11:05:17
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mguo15

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果整个实验室都有问题，是不是质粒有问题了？换新的质粒试试。
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19楼2012-12-21 09:42:46
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platanus

木虫 (著名写手)
★
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这个不是你的连接酶出问题就是你的载体出问题了的！换试剂试一下吧！
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21楼2012-12-21 11:49:03
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小木虫刘树青

木虫 (著名写手)
★
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实验室IPTG, X-gal可能有问题，也有可能提取质粒有问题，重提试试
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22楼2012-12-26 12:36:23
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Marado

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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火舞精灵3: 金币+5 2012-12-29 08:53:02
1：看电泳，你提出来的质粒大小根本不对，3000的质粒+2000的目的条带，根据经验，环形质粒跑出来差不多在3000多点的位置，猜测你提出来的这个是大肠杆菌的基因组碎片.
2：你用了一对T载体上的引物做了一个质粒PCR？是吧.其实PCR这个东西用来作验证是非常不可靠的，可还是很多人喜欢用这个方法，前几天我一师弟做了16管PCR验证，结果非常漂亮，但是提质粒酶切了，全是假阳性.既然你都提质粒了，何不直接单酶切一下，简单准确.
3：蓝白斑，这个已经被我们实验室抛弃很久的方法了，一直用的TAKARA的pMD19-T配合它们家的DH5α，阳性率很可观，随便挑几个菌落基本9成是阳性.
PS:好运.
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23楼2012-12-26 15:23:31
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小木虫刘树青

木虫 (著名写手)
★
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25楼2013-01-24 19:21:59
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