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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接！转化！出问题了！！！！
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)

[交流] 连接！转化！出问题了！！！！

我做的连接转化，后提质粒，利用T载体鉴定试剂盒检测，如图。
   目的基因大约是2000bp，连接载体是Promoge载体pGEM-T载体，转化菌株是JM109菌种
连接后，冻融法转化JM109，涂Amp，IPTG, X-gal 平板。
    问题1.    出现了，平板全是白斑没有蓝斑！！（Promoge载体自连很严重，但却没有了，而且前段时间是有蓝白斑的，就在这一个月没有蓝斑只有白斑，不但我的实验是这样，整个实验室全是白斑，没有蓝斑）

    问题2.    我提质粒显示确是1500的条带（载体大约3000bp），目的基因PCR检测是空白，证明是空载体！！用T载体鉴定试剂盒检测（SP6/T7引物检测）的确是空载体（250bp左右），也同样可以排除1500是细菌基因组DNA的可能性。
   
    求解！！！

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1楼 2012-12-19 13:15:28
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zhaodahe

木虫 (正式写手)
★ ★
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1949stone: 金币+1, 很好的意见 2013-01-25 07:16:29
我也觉得你提取的质粒根本不是质粒，大小差异不会那么大，而且条带很不清晰。而质粒丢失可能是Amp失活。
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8楼2012-12-19 17:09:36
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笑笑天涯

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-19 17:26:14
左边的Marker是lamda Hind3?
这个质粒看着很大啊,为什么不拿酶单切下呢?
2kb稍稍有点大,但是还是连得上的,但是连接效率会低一点
连接不上的可能能也有,还要看连接酶效率
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2楼2012-12-19 15:05:09
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 笑笑天涯 at 2012-12-19 15:05:09
左边的Marker是lamda Hind3?
这个质粒看着很大啊,为什么不拿酶单切下呢?
2kb稍稍有点大,但是还是连得上的,但是连接效率会低一点
连接不上的可能能也有,还要看连接酶效率

左边Marker是LD15000
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3楼2012-12-19 15:51:49
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望海思月

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是不是你们实验室IPTG, X-gal出问题了，检测不出来，恰好你挑的那几个转化子是空连的
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4楼2012-12-19 16:21:19
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