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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆出问题了，大家帮忙分析下
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

[交流] 克隆出问题了，大家帮忙分析下 已有11人参与

这个基因需要做蛋白表达。6月份已经诱导表达出来了，但是菌液忘记保种了。只得重新从头做。但现在克隆出来的片段大小可以，连接转化测序后，片段的顺序却是错的，中间总是少了一段，该是那个环节出问题了呢？PCR扩增就不成功，还是连接转化的问题？重复了两次都是这种情况。该怎么办呢？请大家指点下，谢谢。
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Things change, people grow.
1楼 2012-09-11 10:26:08
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dshlove

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你没有留连接好的质粒嘛？
你这种情况就是模板的问题的，不知道你现在用的是什么模板。
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2楼2012-09-11 12:45:29
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here0009

银虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果少一段，我觉得可能是PCR的问题吧，扩出来就那样，可能是splice variation
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Forthemoon
3楼2012-09-11 16:07:56
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-11 12:45:29
你没有留连接好的质粒嘛？
你这种情况就是模板的问题的，不知道你现在用的是什么模板。

是7月份提的RNA，然后反转录为cDNA，RNA电泳检测还不错。模板一直放在-20°。
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Things change, people grow.
4楼2012-09-12 16:03:16
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by here0009 at 2012-09-11 16:07:56
如果少一段，我觉得可能是PCR的问题吧，扩出来就那样，可能是splice variation

这样的话能表达吗？
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Things change, people grow.
5楼2012-09-12 16:03:31
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lidonghong

金虫 (正式写手)
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-13 14:36:55
连接转化测序后，片段的顺序却是错的，中间总是少了一段
你是怎么看出顺序错了，测序发现的，还有这顺序是指5‘-3’端的顺序吗？
总的看来，模板的问题比较大，先解决这个问题咯！优化条件把你要的基因扩增出来后，直接拿这个产物测个序，如果没有问题，在看看你的酶切位点有没有弄错，如果没有就可以进行下一步了。
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生物化学与分子生物学
6楼2012-09-12 16:35:04
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分子菜鸟

木虫 (小有名气)
★
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检查模版和Taq酶
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7楼2012-09-12 16:43:51
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here0009

银虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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5楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-09-12 16:03:31
这样的话能表达吗？...

编码区变化了，应该不能表达吧，重新扩一次，多筛几个克隆吧
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Forthemoon
8楼2012-09-12 18:47:27
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胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-12 16:35:04
连接转化测序后，片段的顺序却是错的，中间总是少了一段
你是怎么看出顺序错了，测序发现的，还有这顺序是指5‘-3’端的顺序吗？
总的看来，模板的问题比较大，先解决这个问题咯！优化条件把你要的基因扩增出来后 ...

因为已经有全长了。之前也扩出来，因为菌种没保好。要重新做。
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Things change, people grow.
9楼2012-09-13 07:26:25
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ybs007

金虫 (小有名气)
★
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4楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-09-12 16:03:16
是7月份提的RNA，然后反转录为cDNA，RNA电泳检测还不错。模板一直放在-20°。...

你是反转录的cDNA冻存在-20℃还是RNA？ 看你这情况肯定是插入的片段有问题，也就是你从cDNA里扩的那一段有问题。你直接把PCR的产物送去测序看看吧
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平生我自知
10楼2012-09-13 07:37:51
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