应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆出问题了，大家帮忙分析下
161/2返回列表12下一页
查看: 1516  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

[交流] 克隆出问题了，大家帮忙分析下 已有11人参与

这个基因需要做蛋白表达。6月份已经诱导表达出来了，但是菌液忘记保种了。只得重新从头做。但现在克隆出来的片段大小可以，连接转化测序后，片段的顺序却是错的，中间总是少了一段，该是那个环节出问题了呢？PCR扩增就不成功，还是连接转化的问题？重复了两次都是这种情况。该怎么办呢？请大家指点下，谢谢。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Things change, people grow.
1楼 2012-09-11 10:26:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你没有留连接好的质粒嘛？
你这种情况就是模板的问题的，不知道你现在用的是什么模板。
赞一下 回复此楼
2楼2012-09-11 12:45:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

here0009

银虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果少一段，我觉得可能是PCR的问题吧，扩出来就那样，可能是splice variation
赞一下 回复此楼
Forthemoon
3楼2012-09-11 16:07:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-11 12:45:29
你没有留连接好的质粒嘛？
你这种情况就是模板的问题的，不知道你现在用的是什么模板。

是7月份提的RNA，然后反转录为cDNA，RNA电泳检测还不错。模板一直放在-20°。
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
4楼2012-09-12 16:03:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by here0009 at 2012-09-11 16:07:56
如果少一段，我觉得可能是PCR的问题吧，扩出来就那样，可能是splice variation

这样的话能表达吗？
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
5楼2012-09-12 16:03:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-13 14:36:55
连接转化测序后，片段的顺序却是错的，中间总是少了一段
你是怎么看出顺序错了，测序发现的，还有这顺序是指5‘-3’端的顺序吗？
总的看来，模板的问题比较大，先解决这个问题咯！优化条件把你要的基因扩增出来后，直接拿这个产物测个序，如果没有问题，在看看你的酶切位点有没有弄错，如果没有就可以进行下一步了。
赞一下 回复此楼
生物化学与分子生物学
6楼2012-09-12 16:35:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

分子菜鸟

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
检查模版和Taq酶
赞一下 回复此楼
7楼2012-09-12 16:43:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

here0009

银虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-09-12 16:03:31
这样的话能表达吗？...

编码区变化了，应该不能表达吧，重新扩一次，多筛几个克隆吧
赞一下 回复此楼
Forthemoon
8楼2012-09-12 18:47:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-12 16:35:04
连接转化测序后，片段的顺序却是错的，中间总是少了一段
你是怎么看出顺序错了，测序发现的，还有这顺序是指5‘-3’端的顺序吗？
总的看来，模板的问题比较大，先解决这个问题咯！优化条件把你要的基因扩增出来后 ...

因为已经有全长了。之前也扩出来，因为菌种没保好。要重新做。
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
9楼2012-09-13 07:26:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ybs007

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-09-12 16:03:16
是7月份提的RNA，然后反转录为cDNA，RNA电泳检测还不错。模板一直放在-20°。...

你是反转录的cDNA冻存在-20℃还是RNA？ 看你这情况肯定是插入的片段有问题，也就是你从cDNA里扩的那一段有问题。你直接把PCR的产物送去测序看看吧
赞一下 回复此楼
平生我自知
10楼2012-09-13 07:37:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 胡乱走走2011 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐 +8 Ncdx123456 2026-03-13 9/450 2026-03-18 14:40 by haxia
[考研] 一志愿武理材料305分求调剂 +3 想上岸的鲤鱼 2026-03-18 4/200 2026-03-18 14:33 by laoshidan
[考研] 一志愿天津大学化学工艺专业（081702）315分求调剂 +9 yangfz 2026-03-17 9/450 2026-03-18 12:38 by 尽舜尧1
[考研] 材料，纺织，生物（0856、0710），化学招生啦 +3 Eember. 2026-03-17 9/450 2026-03-18 10:28 by Eember.
[考研] 环境工程调剂 +8 大可digkids 2026-03-16 8/400 2026-03-18 09:36 by zhukairuo
[考研] 278求调剂 +5 烟火先于春 2026-03-17 5/250 2026-03-18 08:43 by 星空星月
[考研] 293求调剂 +11 zjl的号 2026-03-16 16/800 2026-03-18 08:10 by zhukairuo
[基金申请] 被我言中：新模板不强调格式了，假专家开始管格式了 +4 beefly 2026-03-14 4/200 2026-03-17 22:04 by 黄鸟于飞Chao
[考研] 材料与化工求调剂 +6 为学666 2026-03-16 6/300 2026-03-17 20:15 by peike
[考研] 290求调剂 +6 孔志浩 2026-03-12 11/550 2026-03-17 14:41 by 周舟舟77
[考研] 275求调剂 +4 太阳花天天开心 2026-03-16 4/200 2026-03-17 10:53 by 功夫疯狂
[考研] 一志愿，福州大学材料专硕339分求调剂 +3 木子momo青争 2026-03-15 3/150 2026-03-17 07:52 by laoshidan
[考研] 283求调剂 +3 听风就是雨； 2026-03-16 3/150 2026-03-17 07:41 by 热情沙漠
[考研] 274求调剂 +5 时间点 2026-03-13 5/250 2026-03-17 07:34 by 热情沙漠
[考研] 318求调剂 +3 Yanyali 2026-03-15 3/150 2026-03-16 16:41 by houyaoxu
[考研] 070300化学学硕求调剂 +6 太想进步了0608 2026-03-16 6/300 2026-03-16 16:13 by kykm678
[考研] 283求调剂 +10 小楼。 2026-03-12 14/700 2026-03-16 16:08 by 13811244083
[考研] 297求调剂 +4 学海漂泊 2026-03-13 4/200 2026-03-14 11:51 by 热情沙漠
[考研] 308 085701 四六级已过求调剂 +7 温乔乔乔乔 2026-03-12 14/700 2026-03-14 10:49 by JourneyLucky
[考研] 材料工程调剂 +9 咪咪空空 2026-03-12 9/450 2026-03-13 22:05 by 星空星月
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭