应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆出问题了，大家帮忙分析下
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
161/2返回列表12下一页
查看: 1529  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)

[交流] 克隆出问题了，大家帮忙分析下 已有11人参与

这个基因需要做蛋白表达。6月份已经诱导表达出来了，但是菌液忘记保种了。只得重新从头做。但现在克隆出来的片段大小可以，连接转化测序后，片段的顺序却是错的，中间总是少了一段，该是那个环节出问题了呢？PCR扩增就不成功，还是连接转化的问题？重复了两次都是这种情况。该怎么办呢？请大家指点下，谢谢。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
Things change, people grow.
1楼 2012-09-11 10:26:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dshlove

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你没有留连接好的质粒嘛？
你这种情况就是模板的问题的，不知道你现在用的是什么模板。
赞一下 回复此楼
2楼2012-09-11 12:45:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

here0009

银虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
如果少一段，我觉得可能是PCR的问题吧，扩出来就那样，可能是splice variation
赞一下 回复此楼
Forthemoon
3楼2012-09-11 16:07:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by dshlove at 2012-09-11 12:45:29
你没有留连接好的质粒嘛？
你这种情况就是模板的问题的，不知道你现在用的是什么模板。

是7月份提的RNA，然后反转录为cDNA，RNA电泳检测还不错。模板一直放在-20°。
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
4楼2012-09-12 16:03:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by here0009 at 2012-09-11 16:07:56
如果少一段，我觉得可能是PCR的问题吧，扩出来就那样，可能是splice variation

这样的话能表达吗？
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
5楼2012-09-12 16:03:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-13 14:36:55
连接转化测序后，片段的顺序却是错的，中间总是少了一段
你是怎么看出顺序错了，测序发现的，还有这顺序是指5‘-3’端的顺序吗？
总的看来，模板的问题比较大，先解决这个问题咯！优化条件把你要的基因扩增出来后，直接拿这个产物测个序，如果没有问题，在看看你的酶切位点有没有弄错，如果没有就可以进行下一步了。
赞一下 回复此楼
生物化学与分子生物学
6楼2012-09-12 16:35:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

分子菜鸟

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
检查模版和Taq酶
赞一下 回复此楼
7楼2012-09-12 16:43:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

here0009

银虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-09-12 16:03:31
这样的话能表达吗？...

编码区变化了，应该不能表达吧，重新扩一次，多筛几个克隆吧
赞一下 回复此楼
Forthemoon
8楼2012-09-12 18:47:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

胡乱走走2011

银虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-12 16:35:04
连接转化测序后，片段的顺序却是错的，中间总是少了一段
你是怎么看出顺序错了，测序发现的，还有这顺序是指5‘-3’端的顺序吗？
总的看来，模板的问题比较大，先解决这个问题咯！优化条件把你要的基因扩增出来后 ...

因为已经有全长了。之前也扩出来，因为菌种没保好。要重新做。
赞一下 回复此楼
Things change, people grow.
9楼2012-09-13 07:26:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ybs007

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 胡乱走走2011 at 2012-09-12 16:03:16
是7月份提的RNA，然后反转录为cDNA，RNA电泳检测还不错。模板一直放在-20°。...

你是反转录的cDNA冻存在-20℃还是RNA？ 看你这情况肯定是插入的片段有问题，也就是你从cDNA里扩的那一段有问题。你直接把PCR的产物送去测序看看吧
赞一下 回复此楼
平生我自知
10楼2012-09-13 07:37:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 胡乱走走2011 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 南京大学化学调剂 +6 景随风 2026-03-29 9/450 2026-03-29 15:27 by 唐沐儿
[考研] 085600 材料与化工 329分求调剂 +13 Mr. Z 2026-03-25 13/650 2026-03-29 15:24 by 唐沐儿
[考研] 297求调剂 +11 田洪有 2026-03-26 11/550 2026-03-29 13:14 by peike
[考研] 一志愿郑州大学，080500学硕，总分317分求调剂 +8 举个栗子oi 2026-03-24 9/450 2026-03-29 13:08 by peike
[考研] 318一志愿吉林大学生物与医药 求调剂 +4 笃行致远. 2026-03-28 4/200 2026-03-29 11:55 by longlotian
[考研] 348求调剂 +5 小懒虫不懒了 2026-03-28 5/250 2026-03-29 10:34 by 唐沐儿
[考研] 085701求调剂初试286分 +4 secret0328 2026-03-28 4/200 2026-03-28 21:09 by 15366876211
[考研] 071000生物学求调剂，初试成绩343 +7 小小甜面团 2026-03-25 7/350 2026-03-28 20:25 by 唐沐儿
[考研] 085602 化工专硕 338分 求调剂 +12 路痴小琪 2026-03-27 12/600 2026-03-28 15:41 by L135790
[考研] 【求调剂】085601材料工程专硕 | 总分272 | +6 脚滑的守法公民 2026-03-27 6/300 2026-03-28 11:02 by gjlllb
[考研] 0856，材料与化工321分求调剂 +12 大馋小子 2026-03-27 13/650 2026-03-28 10:56 by self2008
[材料工程] 一志愿C9材料与化工专业总分300求调剂 +8 曼111 2026-03-24 9/450 2026-03-28 07:58 by YYYYX1234
[考研] 331环境科学与工程求调剂 +3 熠然好运气 2026-03-27 3/150 2026-03-28 04:11 by fmesaito
[考研] 085600材料与化工调剂 +10 A-哆啦Z梦 2026-03-23 16/800 2026-03-27 15:13 by caszguilin
[考研] 321求调剂 +6 Ymlll 2026-03-24 6/300 2026-03-26 20:50 by 不吃魚的貓
[考研] 环境专硕324分求调剂推荐 +5 轩小宁—— 2026-03-26 5/250 2026-03-26 12:05 by i_cooler
[考研] 考研一志愿苏州大学初始315（英一）求调剂 +3 sbdksD 2026-03-24 4/200 2026-03-25 18:16 by xcjcqu
[考研] 求b区院校调剂 +4 周56 2026-03-24 5/250 2026-03-25 17:12 by yishunmin
[考研] 求调剂 +6 研研，接电话 2026-03-24 7/350 2026-03-24 17:01 by barlinike
[考研] 材料专硕331求调剂 +4 鲜当牛 2026-03-24 4/200 2026-03-24 15:58 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭