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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 3Kbp片段转化连接问题
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sunbeartao

新虫 (小有名气)

[求助] 3Kbp片段转化连接问题

请各位师兄师姐帮忙：三千左右的片段用LA TAQ从模板扩增得到，胶回收后跑胶验证，比较亮的。连接TAKARA的PMD 19-T SIMPLE，体系是solution 5 ul, 载体1ul，片段4.5ul,连接9小时左右，涂板（氨苄），长14小时左右，十个菌落左右，跑菌落PCR没有条带（一条也没有），拿去测序却是1500左右的片段。现在在做第二次，菌落PCR还是没有。提质粒酶切这里不太试用（载体大小和片段差不多，一个是2700，一个2900）。请教各位大师。ps 平板刚倒的，连接酶和感受态JM109没问题（师姐能做出来）
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22
1楼 2012-11-14 15:44:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
sunbeartao: 金币+15, ★★★★★最佳答案 2013-01-01 22:31:03
你单酶切一下对比ladder看看质粒大小。如果是5-6kb的话估计差不多了。此外再选一个插入目的基因内部特有的酶切位点验证目构建载体上有目的基因。
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2楼2012-11-15 09:08:58
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sunbeartao

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-15 09:08:58
你单酶切一下对比ladder看看质粒大小。如果是5-6kb的话估计差不多了。此外再选一个插入目的基因内部特有的酶切位点验证目构建载体上有目的基因。

谢谢您的帮助，想请教下如果不酶切直接用质粒跑电泳可不可以，对条带大小会不会有影响？后半句“此外再选一个插入目的基因内部特有的酶切位点验证目构建载体上有目的基因。”没看懂，望多多指点。谢谢
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22
3楼2012-11-15 13:24:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
sunbeartao: 金币+10, ★有帮助 2012-12-11 12:50:54
sunbeartao: 金币+15 2013-01-01 22:30:51
引用回帖:
3楼: Originally posted by sunbeartao at 2012-11-15 13:24:11
谢谢您的帮助，想请教下如果不酶切直接用质粒跑电泳可不可以，对条带大小会不会有影响？后半句“此外再选一个插入目的基因内部特有的酶切位点验证目构建载体上有目的基因。”没看懂，望多多指点。谢谢...

不做酶切的话质粒有三种形式，用盒子提的基本都是超螺旋形式，电泳跑得比线性分子（marker）中同样分子量的带要快，所以不容易判断大小。后面半句的意思是你把构建好的载体序列做一下酶切位点分析，找一下只存在于目的基因里（空载体没有）的酶，然后做下酶切。如果能切动的话说明构建载体里含有目的片段。再加上前面说的单酶切判断质粒大小，这样做比较保险。
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4楼2012-11-15 13:46:24
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sunbeartao

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-15 13:46:24
不做酶切的话质粒有三种形式，用盒子提的基本都是超螺旋形式，电泳跑得比线性分子（marker）中同样分子量的带要快，所以不容易判断大小。后面半句的意思是你把构建好的载体序列做一下酶切位点分析，找一下只存在于 ...

怎么知道有没有切动？
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22
5楼2012-11-15 14:36:12
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乐乐3952

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by sunbeartao at 2012-11-15 14:36:12
怎么知道有没有切动？...

一般你酶连转化之后，提取的质粒是超螺旋状态的，你单酶切之后就是线性的了，条带就大了。双酶切的话就是有你的目的条带，切不出来来的话就有问题了……祝好运
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一花一世界、一叶一菩提
6楼2012-11-15 15:28:00
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sunbeartao

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 乐乐3952 at 2012-11-15 15:28:00
一般你酶连转化之后，提取的质粒是超螺旋状态的，你单酶切之后就是线性的了，条带就大了。双酶切的话就是有你的目的条带，切不出来来的话就有问题了……祝好运...

谢谢你
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22
7楼2012-11-15 19:37:32
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