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sunbeartao新虫 (小有名气)
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3Kbp片段转化连接问题
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| 请各位师兄师姐帮忙：三千左右的片段用LA TAQ从模板扩增得到，胶回收后跑胶验证，比较亮的。连接TAKARA的PMD 19-T SIMPLE，体系是solution 5 ul, 载体1ul，片段4.5ul,连接9小时左右，涂板（氨苄），长14小时左右，十个菌落左右，跑菌落PCR没有条带（一条也没有），拿去测序却是1500左右的片段。现在在做第二次，菌落PCR还是没有。提质粒酶切这里不太试用（载体大小和片段差不多，一个是2700，一个2900）。请教各位大师。ps 平板刚倒的，连接酶和感受态JM109没问题（师姐能做出来） |
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不做酶切的话质粒有三种形式，用盒子提的基本都是超螺旋形式，电泳跑得比线性分子（marker）中同样分子量的带要快，所以不容易判断大小。后面半句的意思是你把构建好的载体序列做一下酶切位点分析，找一下只存在于目的基因里（空载体没有）的酶，然后做下酶切。如果能切动的话说明构建载体里含有目的片段。再加上前面说的单酶切判断质粒大小，这样做比较保险。 |
4楼2012-11-15 13:46:24
sunbeartao
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