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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)


[交流] 连接!转化!出问题了!!!!

我做的连接转化,后提质粒,利用T载体鉴定试剂盒检测,如图。
   目的基因大约是2000bp,连接载体是Promoge载体pGEM-T载体,转化菌株是JM109菌种
连接后,冻融法转化JM109,涂Amp,IPTG, X-gal 平板。
    问题1.    出现了,平板全是白斑没有蓝斑!!(Promoge载体自连很严重,但却没有了,而且前段时间是有蓝白斑的,就在这一个月没有蓝斑只有白斑,不但我的实验是这样,整个实验室全是白斑,没有蓝斑)

    问题2.    我提质粒显示确是1500的条带(载体大约3000bp),目的基因PCR检测是空白,证明是空载体!!用T载体鉴定试剂盒检测(SP6/T7引物检测)的确是空载体(250bp左右),也同样可以排除1500是细菌基因组DNA的可能性。
   
    求解!!!

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望海思月

铜虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
是不是你们实验室IPTG, X-gal出问题了,检测不出来,恰好你挑的那几个转化子是空连的
4楼2012-12-19 16:21:19
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笑笑天涯

木虫 (小有名气)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-19 17:26:14
左边的Marker是lamda Hind3?
这个质粒看着很大啊,为什么不拿酶单切下呢?
2kb稍稍有点大,但是还是连得上的,但是连接效率会低一点
连接不上的可能能也有,还要看连接酶效率
2楼2012-12-19 15:05:09
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by 笑笑天涯 at 2012-12-19 15:05:09
左边的Marker是lamda Hind3?
这个质粒看着很大啊,为什么不拿酶单切下呢?
2kb稍稍有点大,但是还是连得上的,但是连接效率会低一点
连接不上的可能能也有,还要看连接酶效率

左边Marker是LD15000
3楼2012-12-19 15:51:49
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火舞精灵3

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
4楼: Originally posted by 望海思月 at 2012-12-19 16:21:19
是不是你们实验室IPTG, X-gal出问题了,检测不出来,恰好你挑的那几个转化子是空连的

这个??
的确IPTG和X-gal是很久了,最近还配不了新的过滤膜没了
        那质粒为什么会在15000bp左右呢?
5楼2012-12-19 16:25:16
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