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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化交流贴
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20083630zhan

木虫 (正式写手)

[交流] 连接转化交流贴

大家把自己连接转化遇到的困难以及经验写下来吧，
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1楼 2013-05-15 22:09:17
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sunnyboylg

木虫 (正式写手)
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20083630zhan(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:00
这几天做质粒转化，一直没长出菌来，我想想估计是质粒酶切跑电泳切胶回收浓度太低了，都没有多少质粒转进去，而且感受态细胞浓度也不够高。总之都是浓度低惹的祸
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2楼2013-05-15 22:17:56
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yiloutingyu

铜虫 (小有名气)
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20083630zhan(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:08
已经做了一个月了，还是没做出来，一直涂板长不出来，后来找到原因，是大肠杆菌的原因，换了 做场感受态之后，能长出来，挑单菌落后摇不起来。就这样耗着，前面都没问题，我也各种验证，现在在怀疑我的感受态试剂盒。连接以前是在16度 水浴过夜，现在换成4度冰箱里冰浴过夜，效果好一些。在转化的过程中，最好是42度 热击90秒。
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4楼2013-05-15 23:22:07
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光树林

木虫 (著名写手)
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20083630zhan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-19 18:16:31
回收浓度确实有一定的影响，主要是最好16度多连接一会儿，过夜挺好的
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5楼2013-05-16 00:00:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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20083630zhan(myprayer代发): 金币+1, 感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-16 08:24:17
有时候感受态细胞不是特别理想。自己制备的感受态用氨苄的抗性板有时候负对照会长克隆。
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6楼2013-05-16 06:45:36
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
我的也是，最近一段时间做转化，菌P时候有条带，但是培养之后提取质粒后酶切，没有目的条带。做了几次都是这样，感觉应该是转化除了什么问题
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7楼2013-05-16 08:27:21
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shenmh_1987

新虫 (初入文坛)
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20083630zhan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-19 18:16:50
1.感受态质量要有保障，实在不行就用商业化的感受态，免得在连接转化这种小问题上纠结好久
2.连接时片段载体比例要适中
3.转化过程中不能让感受态受热，热激时间根据感受态不同严格把握
4.热激后迅速放于冰上，且避免震动。
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8楼2013-05-18 19:57:19
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
个人觉得电转化的效率比化学转化的效率高出许多，并且，操作还简单
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10楼2013-05-19 09:34:27
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莓林塔

木虫 (小有名气)
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-19 18:17:09
引用回帖:
10楼: Originally posted by 20083630zhan at 2013-05-19 09:34:27
个人觉得电转化的效率比化学转化的效率高出许多，并且，操作还简单

TA连接的体系本身就是高离子浓度的，不适宜用电转啊，电转转个质粒啥的还是不错的。。而且我昨天也电转了，还是没长！！！好讨厌啊，还没找到原因。。。
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11楼2013-05-19 14:43:11
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莓林塔

木虫 (小有名气)
我的现在就出鬼了一样，我老师现在只能安慰我说，会做出来的，总会做出来的继续找原因吧，哎
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12楼2013-05-19 14:45:03
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 莓林塔 at 2013-05-19 14:43:11
TA连接的体系本身就是高离子浓度的，不适宜用电转啊，电转转个质粒啥的还是不错的。。而且我昨天也电转了，还是没长！！！好讨厌啊，还没找到原因。。。...

我用的载体是PUC19，感觉电转化效率比化学方法好，但是，最近挑单菌落PCR偶条带，提取质粒酶切总是没有条带，好桑心啊
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13楼2013-05-20 11:17:46
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hanyueV5

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by yiloutingyu at 2013-05-15 23:22:07
已经做了一个月了，还是没做出来，一直涂板长不出来，后来找到原因，是大肠杆菌的原因，换了 做场感受态之后，能长出来，挑单菌落后摇不起来。就这样耗着，前面都没问题，我也各种验证，现在在怀疑我的感受态试剂盒 ...

我的也是，前面都没问题，就是转化的单菌落摇不起来，要不就是出现大量的空载体，甚至是连载体都没有的假阳性，而且我的还是两个不同的实验，不同的材料····这到底是什么原因什么原因，我严重怀疑是转化出问题了，可这都是实验室的老方法，以前都ok的啊
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14楼2013-05-20 13:18:39
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yiloutingyu

铜虫 (小有名气)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by hanyueV5 at 2013-05-20 13:18:39
我的也是，前面都没问题，就是转化的单菌落摇不起来，要不就是出现大量的空载体，甚至是连载体都没有的假阳性，而且我的还是两个不同的实验，不同的材料····这到底是什么原因什么原因，我严重怀疑是转化出问题 ...

我今天刚用氯化钙法重新做了感受态，已经转化了，看明天的结果吧。
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15楼2013-05-20 20:25:18
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yingying15883楼
2013-05-15 22:48   回复  
wandsy9楼
2013-05-18 21:32   回复  
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