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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 怎么老是连接失败？
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wncgliu86

金虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-20 10:18:36
你何不PCR产物ta下，测序对了再切
...

你的意思是转T载体后再连接？
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11楼2014-05-20 10:59:42
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by wncgliu86 at 2014-05-20 10:59:42
你的意思是转T载体后再连接？...

是滴，我一直这样弄的，比较踏实一点，尽管多花点时间

[ 发自小木虫客户端 ]
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12楼2014-05-20 12:02:17
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
调整连接比例，或者换下回收方法
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努力打败一切
13楼2014-05-20 23:31:33
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meng_xu

铜虫 (小有名气)
你是两个PCR片段连接，还是两个PCR片段和载体分别连接，还是两个PCR片段连接，然后连接到载体里？

最简单的办法，就是每个PCR都连接到载体里，然后转化，测序，再做二次连接，这样成功率高，虽然费时，但是也就是一次连接和转化＋筛选，也就是2－3天的时间而已。

连接我的做法一般都是：20ul体系里面1ul NEB T4 ligase，room temp 45 min， 然后转化，效率还不错，一般都可以有几十以上的菌落。

上面的朋友，4度连接是什么原理呢？16度是最适宜温度，好像不高吧？
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14楼2014-05-21 06:11:28
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dongge2013

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wncgliu86 at 2014-05-20 09:33:23
PCR产物双酶切后回收...

是在引物两端加的酶切位点？如果是，那你加保护碱基了吗？
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15楼2014-05-21 16:24:21
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