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wncgliu86

金虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by Neo2000 at 2014-05-20 10:18:36
你何不PCR产物ta下,测序对了再切
...

你的意思是转T载体后再连接?
11楼2014-05-20 10:59:42
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by wncgliu86 at 2014-05-20 10:59:42
你的意思是转T载体后再连接?...

是滴,我一直这样弄的,比较踏实一点,尽管多花点时间

[ 发自小木虫客户端 ]
12楼2014-05-20 12:02:17
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yangjingjing

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
调整连接比例,或者换下回收方法
努力打败一切
13楼2014-05-20 23:31:33
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meng_xu

铜虫 (小有名气)

你是两个PCR片段连接,还是两个PCR片段和载体分别连接,还是两个PCR片段连接,然后连接到载体里?

最简单的办法,就是每个PCR都连接到载体里,然后转化,测序,再做二次连接,这样成功率高,虽然费时,但是也就是一次连接和转化+筛选,也就是2-3天的时间而已。

连接我的做法一般都是:20ul体系里面1ul NEB T4 ligase,room temp 45 min, 然后转化,效率还不错,一般都可以有几十以上的菌落。

上面的朋友,4度连接是什么原理呢?16度是最适宜温度,好像不高吧?
14楼2014-05-21 06:11:28
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dongge2013

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by wncgliu86 at 2014-05-20 09:33:23
PCR产物双酶切后回收...

是在引物两端加的酶切位点?如果是,那你加保护碱基了吗?
15楼2014-05-21 16:24:21
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