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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒大提的疑问！！高手进来解答一下~
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sweleon

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒大提的疑问！！高手进来解答一下~

最近在质粒抽提上出了问题。原来用omega的试剂盒提，产率很低，不知道是不是因为质粒拷贝数比较低的问题（用氯霉素处理没有效果，质粒本身是松弛型质粒）。因为试剂盒的液体比较少，没几下就用光了。现在柱子留了很多~

这两天又按照经典碱法抽提质粒，溶液配方用takara产品目录后面的配方配比，这里又遇到一个问题，我配的10%SDS在室温20度条件下结晶沉淀很严重，基本看不到多少可以流动的液体，这个问题也不知道为什么。看了网上很多同学的帖子，找不到原因。SDS试剂是阿拉丁的牌子。

经过预热以后，soultion2里面的SDS是溶解的，然后我离心200ml左右的菌液，按照7ml soultion1（RNAse A浓度75ug/ml），10ml soultion2, 10ml soultion3，再用1/3体积酚氯仿抽提，2倍体积乙醇沉淀，75%乙醇洗清，全程都在室温条件操作，最后TE溶解（RNAse A 浓度50ug/ml)，37度降解2h，电泳检查，得到的产物基本都是RNA，质粒少的可怜。弄的我都不知道该怎么处理了。

现在考虑：
①是不是质粒拷贝不够，打算小提后重新做转化，提高菌体质粒拷贝数。
②用合格的裂解程序，最后上吸附柱，提高得率。

疑问：
①经典酚氯仿抽提法操作步骤有没问题，怎么才能提取到大量质粒？
②裂解溶液配置是否存在问题？
③剩余的omega柱子怎么使用？

高手不吝赐教啊~实验进度严重滞后了！！！！
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1楼2013-11-04 19:04:25
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励交流！ 2013-11-05 12:41:22
如果是低拷贝质粒，当然提取量要少一些。一般多收些菌就OK了。
SDS温度低了容易结晶析出，用37°C下结晶就会完全溶解，可以继续用。
kir也是用碱法裂解的。如果你还有很多柱子，直接把裂解后的溶液过柱子就好了。如果你的质粒拷贝数低，如果没有达到柱子饱和吸附量，直接多上一些裂解物吸附就是了。
SDS配好的母液最好保存在22-25°C。
如果你提出来的质粒含有很多RNA，说明你的RNase处理有问题。未经RNase处理的样品通常会含有很多RNA，质粒的带当然不亮了。一般提质粒时是在溶液I里加RNase的，不用在TE里再加了。
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2楼2013-11-05 09:43:57
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这几天我也大提质粒，欧米伽那个我用了两次，效果都不太好，准备用碱法提质粒，我问过同学，rna酶是在实验中加的，不是最后洗下来才加，而且他们37度消化四个小时，完了我给你把他们的步骤传上来你试着做一下，我这几天也要做
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
3楼2013-11-18 17:25:00
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梧桐柒夕

主管区长 (文坛精英)

优秀区长优秀区长优秀区长优秀区长优秀版主优秀版主优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

OMEGA的试剂盒是很不错的，估计是操作的问题，你可以尝试再做一次。我第一次使用时效果很不好，但第二次再使用时效果真的很惊人。我是做试剂盒的，不得不承认人家试剂盒做的真好，就是贵。
RNase A也可以在最后放的，看实验习惯，RNA很易降解，如果是弥散状也不能排除有蛋白的可能。提取时最好是冰浴，我提的时候是室温，但离心都是4℃下离心的，所用的溶液最好都是冰浴过的，或者是在4℃冰箱里贮存，使用时再取出，蛋白多糖等杂质在高盐/低温下会更易沉淀析出。溶液二最好现用现配，现用现配效果很好，如果你的NaOH浓度是2M的话就现用现配吧。
10%SDS配置时68℃助溶后，室温下放置是不会析出的，现在北京实验室温度低于20，也没有析出，你可以再试试，我配的放了一个多月都没事儿。
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轻描淡写，浓墨重彩。
4楼2013-11-18 18:34:54
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doglet

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我大提都是用碱裂解法手提的，液体配方是用分子克隆第二版，纯化方法是PEG8000的方法，也是分子克隆第二版上的，基本上如果不是质粒拷贝数的问题，都可以很好的提取，并且260/280基本上在1.8左右，而且质粒量也很不错。II液现配与不现配不影响质粒提取，只要浓度对并且是透明液体，没有析出就好，但是III液一定要冰浴后使用，如果酸度不够的话，就要重配，否则很影响提取的量。
我们科室如果用试剂盒会用QIAGEN的，质量很好，但是用注意提取质粒的范围，有些是小于40kb的试剂盒，有些可以提大质粒的，但是手提不存在这个问题，因为试剂盒过柱时有个剪切的最用，对大质粒有影响。
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5楼2013-11-18 20:52:15
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xiaohaixie

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

1、50ml  5000转 5分钟
2、弃上清、3ml 溶液一，混匀
3、3ml溶液二，混匀，冰上3min，总时间不超5min
4、3ml溶液三，颠倒混匀（轻柔），冰上5min，9000转10分钟，取上清，加1ml氯仿、1mltris-饱和酚，颠倒几次，5000转5min
5、取上清，加等体积异丙醇，震荡，-80度10分钟，11000转20min，70%乙醇洗两遍，弃洗液
6、无菌环境下晾干乙醇，加1ml超纯水溶解
7、加适量rna酶，37度消化4小时
8、加200ultris-饱和酚，12000转2min，取上清，200ul氯仿，12000转2min，再加氯仿，同样操作
9、加1/10体积溶液三，再加等体积异丙醇，震荡
10、14500转15min，弃上清，用70%乙醇洗两次
11、无菌环境干燥，晾干乙醇，加适量水溶解（依提出来的量和所需浓度自己定）
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Thehardyouwork,theluckyyouwill.年轻就要多吃苦
6楼2013-11-23 09:44:17
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