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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求全质粒定点突变高手解疑问
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c3024034

银虫 (正式写手)

[求助] 求全质粒定点突变高手解疑问

最近做全质粒定点突变，很长时间都没什么进展，想找一位有经验的虫友给予帮组，具体问题很多，请加我QQ好友277057268，万分感谢
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1楼 2011-08-02 13:07:39
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longage.gene

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
dhd997(金币+1): good 2011-08-03 08:21:18
c3024034(金币+2): 谢谢帮组 2011-08-03 13:35:48
你突变几个点？你用的什么方法？质粒多长？这个好像不难，如果点不多；点多的话也就多几步而已。
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2楼2011-08-02 20:13:14
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-03 08:21:09
具体说说有什么问题，大家帮你讨论下。
全质粒PCR定点突变有试剂盒的，有线性扩增的，也有指数扩增的。不知道你是线性的还是指数的引物。
另外做定点突变也可以试试大引物、重叠PCR的方法。
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3楼2011-08-02 22:49:52
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cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 学下 2011-08-04 18:54:40
GenScript  有自己的软件，可以设计客户要求的点突变。根据不同宿主密码子的偏爱性设计，另外还考虑很多提高表达量的因素。一般10bp 以内可以设计一对引物来当作一个点突变来处理。
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净——静——竞——进
4楼2011-08-02 22:57:13
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c3024034

银虫 (正式写手)
我没有用试剂盒， 具体就是用一般的网上的方法，单买的PFU-DNA聚合酶 DNPI酶，DH5a转化。我的质粒全长有7KB。要突变上面的赖氨酸，大约要突变13个点，但现在设计的大约10个引物一个都没扩增出来。
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5楼2011-08-03 13:38:49
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c3024034

银虫 (正式写手)
每次突变一个点，你们设计引物怎么设计啊 ？
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6楼2011-08-03 13:46:55
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-08-04 18:54:50
如果是点突变可以设计引物扩增实现，如果是一段序列的突变那就全基因合成后替换原序列
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
7楼2011-08-03 14:13:03
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c3024034

银虫 (正式写手)
我是质粒上的突变，用什么设计引物好啊？
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8楼2011-08-03 15:21:46
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c3024034

银虫 (正式写手)
其实我觉的最主要的是设计引物的正确性，但引物设计也涉及很多问题啊，谁能帮我看看我的引物怎么样啊？
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9楼2011-08-03 15:25:46
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longage.gene

银虫 (小有名气)
★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-08-04 18:55:05
你引物设计多长？突变点放在靠近5‘端。
PFU-DNA聚合酶 DNPI酶，DH5a转化，足够了，再加连接酶的话。
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10楼2011-08-04 17:42:22
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