求全质粒定点突变高手解疑问 - 分子生物 - 综合其他 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

11楼2011-08-04 17:45:46

空谷幽风

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8楼: Originally posted by c3024034 at 2011-08-03 15:21:46:
我是质粒上的突变，用什么设计引物好啊？

你的意思是用什么软件来设计引物？primer5就可以

a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?

12楼2011-08-04 19:02:20

longage.gene

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12楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-04 19:02:20:
你的意思是用什么软件来设计引物？primer5就可以

楼主他想定点突变的话，引物基本没得选。有时要突变的附近序列不好p也没办法。我的经验是质粒突变的话，没那么复杂。

13楼2011-08-05 10:59:09

quiller2000

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不知道你做出来没有，我们做过很多，就是用质粒做的，好像挺容易的；可以给你试试，反正现在也没有什么事情

致良知

14楼2011-08-05 15:23:40

匿名

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15楼2012-04-30 16:09:11

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艰苦温度

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11楼: Originally posted by longage.gene at 2011-08-04 17:45:46
设计的大约10个引物一个都没扩增出来------你怎么判断？！
切记，cycle别多，你7k的话，7cycle就够了。这样pcr产物跑电泳有可能看不到的！当然能看到最好。我一般50ulpcr体系，跑电泳10ul。

7个循环感觉希望渺茫啊。
问个细节问题，我最近也在做定点突变，50ul体系，模板加入20ng，7kb质粒，延伸时间7min，终延伸7min，25个循环和30个循环都没有产物，电泳检测用了5ul。
请问哪里出问题了？循环太多了吗？拜谢！

16楼2014-06-06 23:55:49

longage.gene

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2年没做这方面的实验了，记得不是很清楚。我看了下我自己之前的留言，意思应该是不要太多cycle，多了可能不好，为什么不好，我不记得了，但是我当时这样说的话肯定是有原因的。你可以先尝试少cycle试试，仔细看你的酶的说明书。

17楼2014-06-11 15:28:00