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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求全质粒定点突变高手解疑问
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c3024034

银虫 (正式写手)

[求助] 求全质粒定点突变高手解疑问

最近做全质粒定点突变，很长时间都没什么进展，想找一位有经验的虫友给予帮组，具体问题很多，请加我QQ好友277057268，万分感谢
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1楼 2011-08-02 13:07:39
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艰苦温度

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by longage.gene at 2011-08-04 17:45:46
设计的大约10个引物一个都没扩增出来------你怎么判断？！
切记，cycle别多，你7k的话，7cycle就够了。这样pcr产物跑电泳有可能看不到的！当然能看到最好。我一般50ulpcr体系，跑电泳10ul。

7个循环感觉希望渺茫啊。
问个细节问题，我最近也在做定点突变，50ul体系，模板加入20ng，7kb质粒，延伸时间7min，终延伸7min，25个循环和30个循环都没有产物，电泳检测用了5ul。
请问哪里出问题了？循环太多了吗？拜谢！
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16楼2014-06-06 23:55:49
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longage.gene

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
dhd997(金币+1): good 2011-08-03 08:21:18
c3024034(金币+2): 谢谢帮组 2011-08-03 13:35:48
你突变几个点？你用的什么方法？质粒多长？这个好像不难，如果点不多；点多的话也就多几步而已。
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2楼2011-08-02 20:13:14
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gwbk

木虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-03 08:21:09
具体说说有什么问题，大家帮你讨论下。
全质粒PCR定点突变有试剂盒的，有线性扩增的，也有指数扩增的。不知道你是线性的还是指数的引物。
另外做定点突变也可以试试大引物、重叠PCR的方法。
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3楼2011-08-02 22:49:52
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cloverplm

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 学下 2011-08-04 18:54:40
GenScript  有自己的软件，可以设计客户要求的点突变。根据不同宿主密码子的偏爱性设计，另外还考虑很多提高表达量的因素。一般10bp 以内可以设计一对引物来当作一个点突变来处理。
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净——静——竞——进
4楼2011-08-02 22:57:13
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