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质粒大提的疑问！！高手进来解答一下~
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最近在质粒抽提上出了问题。原来用omega的试剂盒提，产率很低，不知道是不是因为质粒拷贝数比较低的问题（用氯霉素处理没有效果，质粒本身是松弛型质粒）。因为试剂盒的液体比较少，没几下就用光了。现在柱子留了很多~ 这两天又按照经典碱法抽提质粒，溶液配方用takara产品目录后面的配方配比，这里又遇到一个问题，我配的10%SDS在室温20度条件下结晶沉淀很严重，基本看不到多少可以流动的液体，这个问题也不知道为什么。看了网上很多同学的帖子，找不到原因。SDS试剂是阿拉丁的牌子。 经过预热以后，soultion2里面的SDS是溶解的，然后我离心200ml左右的菌液，按照7ml soultion1（RNAse A浓度75ug/ml），10ml soultion2, 10ml soultion3，再用1/3体积酚氯仿抽提，2倍体积乙醇沉淀，75%乙醇洗清，全程都在室温条件操作，最后TE溶解（RNAse A 浓度50ug/ml)，37度降解2h，电泳检查，得到的产物基本都是RNA，质粒少的可怜。弄的我都不知道该怎么处理了。 现在考虑： ①是不是质粒拷贝不够，打算小提后重新做转化，提高菌体质粒拷贝数。 ②用合格的裂解程序，最后上吸附柱，提高得率。 疑问： ①经典酚氯仿抽提法操作步骤有没问题，怎么才能提取到大量质粒？ ②裂解溶液配置是否存在问题？ ③剩余的omega柱子怎么使用？ 高手不吝赐教啊~实验进度严重滞后了！！！！ |
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cicelyzh
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励交流！ 2013-11-05 12:41:22
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如果是低拷贝质粒，当然提取量要少一些。一般多收些菌就OK了。 SDS温度低了容易结晶析出，用37°C下结晶就会完全溶解，可以继续用。 kir也是用碱法裂解的。如果你还有很多柱子，直接把裂解后的溶液过柱子就好了。如果你的质粒拷贝数低，如果没有达到柱子饱和吸附量，直接多上一些裂解物吸附就是了。 SDS配好的母液最好保存在22-25°C。 如果你提出来的质粒含有很多RNA，说明你的RNase处理有问题。未经RNase处理的样品通常会含有很多RNA，质粒的带当然不亮了。一般提质粒时是在溶液I里加RNase的，不用在TE里再加了。 |
2楼2013-11-05 09:43:57
3楼2013-11-18 17:25:00
梧桐柒夕
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【答案】应助回帖
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OMEGA的试剂盒是很不错的，估计是操作的问题，你可以尝试再做一次。我第一次使用时效果很不好，但第二次再使用时效果真的很惊人。我是做试剂盒的，不得不承认人家试剂盒做的真好，就是贵。 RNase A也可以在最后放的，看实验习惯，RNA很易降解，如果是弥散状也不能排除有蛋白的可能。提取时最好是冰浴，我提的时候是室温，但离心都是4℃下离心的，所用的溶液最好都是冰浴过的，或者是在4℃冰箱里贮存，使用时再取出，蛋白多糖等杂质在高盐/低温下会更易沉淀析出。溶液二最好现用现配，现用现配效果很好，如果你的NaOH浓度是2M的话就现用现配吧。 10%SDS配置时68℃助溶后，室温下放置是不会析出的，现在北京实验室温度低于20，也没有析出，你可以再试试，我配的放了一个多月都没事儿。 |
4楼2013-11-18 18:34:54
【答案】应助回帖
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我大提都是用碱裂解法手提的，液体配方是用分子克隆第二版，纯化方法是PEG8000的方法，也是分子克隆第二版上的，基本上如果不是质粒拷贝数的问题，都可以很好的提取，并且260/280基本上在1.8左右，而且质粒量也很不错。II液现配与不现配不影响质粒提取，只要浓度对并且是透明液体，没有析出就好，但是III液一定要冰浴后使用，如果酸度不够的话，就要重配，否则很影响提取的量。 我们科室如果用试剂盒会用QIAGEN的，质量很好，但是用注意提取质粒的范围，有些是小于40kb的试剂盒，有些可以提大质粒的，但是手提不存在这个问题，因为试剂盒过柱时有个剪切的最用，对大质粒有影响。 |
5楼2013-11-18 20:52:15
【答案】应助回帖
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1、50ml 5000转 5分钟 2、弃上清、3ml 溶液一，混匀 3、3ml溶液二，混匀，冰上3min，总时间不超5min 4、3ml溶液三，颠倒混匀（轻柔），冰上5min，9000转10分钟，取上清，加1ml氯仿、1mltris-饱和酚，颠倒几次，5000转5min 5、取上清，加等体积异丙醇，震荡，-80度10分钟，11000转20min，70%乙醇洗两遍，弃洗液 6、无菌环境下晾干乙醇，加1ml超纯水溶解 7、加适量rna酶，37度消化4小时 8、加200ultris-饱和酚，12000转2min，取上清，200ul氯仿，12000转2min，再加氯仿，同样操作 9、加1/10体积溶液三，再加等体积异丙醇，震荡 10、14500转15min，弃上清，用70%乙醇洗两次 11、无菌环境干燥，晾干乙醇，加适量水溶解（依提出来的量和所需浓度自己定） |
6楼2013-11-23 09:44:17
