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小朱大宝

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR反应体系改变会导致电泳不出带吗 已有2人参与

以反转录后的cDNA为模板，在扩增管家基因（18s RNA）的时候，刚开始用的是10μl反应体系，体系中用的是PCR Mix，电泳后有出现条带。但由于是新手的关系，忘记加空白对照跟Marker，加上电泳时间长了一点，所以无法确定P出来的条带是否为目的的管家基因。因此，后来又重新做了一次实验，这次用的是25μl反应体系，而且没有用PCR Mix，用的是HSTaq酶。就只是改变了反应体系，PCR反应条件一直没有改变，但是电泳后跑不出条带。

10μl反应体系：                                       25μl反应体系:                                             
PCR Mix    5                                          10X  Buffer         2.5
Pf             0.2                                        dNTPs               2
pr            0.2                                         pf                      0.2
cDNA       0.5                                        pr                     0.5
ddH2O    4.1                                        Taq                  0.125
                                                            cDNA               1
                                                            ddH2O              18.675
total       10 μl                                      total                   25μl

请问各位高手，是哪里出了问题。

PCR反应体系改变会导致电泳不出带吗
10μl反应体系电泳图.jpg
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1楼 2014-10-20 15:52:26
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peterrjp

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-20 19:44:53
小朱大宝: 金币+3 2014-10-21 14:26:23
跟体系的扩大没关系。应该跟你用的试剂不同有关。你第一次用的mix，又没有加对照，无法确定是不是mix本身污染导致的条带。第二次用的HSTaq酶体系，没有阳性对照，不能排除试剂是否有问题，比如酶失活了。你这个图是第一次还是第二次？
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2楼2014-10-20 16:42:02
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小朱大宝

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by peterrjp at 2014-10-20 16:42:02
跟体系的扩大没关系。应该跟你用的试剂不同有关。你第一次用的mix，又没有加对照，无法确定是不是mix本身污染导致的条带。第二次用的HSTaq酶体系，没有阳性对照，不能排除试剂是否有问题，比如酶失活了。你这个图是 ...

是第一次的10μl体系的图，用PCR Mix去扩增的。用HS Taq酶的体系，实验组与阴性对照组都没有条带，只有Marker跑出条带
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3楼2014-10-20 17:21:04
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peterrjp

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
小朱大宝: 金币+1, ★有帮助 2014-10-21 14:25:52
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小朱大宝 at 2014-10-20 17:21:04
是第一次的10μl体系的图，用PCR Mix去扩增的。用HS Taq酶的体系，实验组与阴性对照组都没有条带，只有Marker跑出条带...

PCR一次两次失败很正常的。用HS Taq酶重做一边，加上阳性对照试试吧，看看是不是酶的问题。pcr mix相对来说容易扩出污染条带，阴性对照是不可少的
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4楼2014-10-20 19:27:51
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yelon315

禁虫 (小有名气)
★
感谢参与，应助指数 +1
小朱大宝: 金币+1, ★有帮助 2014-10-22 15:02:01
本帖内容被屏蔽
5楼2014-10-21 01:21:31
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HalaRoller

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yelon315 at 2014-10-21 01:21:31
建议：克隆基因的时候不要用mix，用taq 或者高保真酶~~18s 片段不大用taq就好。。

请问为什么克隆基因的时候不要用MIX而要推荐用Taq或者高保真酶呢？我是新手小白，谢谢指点！
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6楼2015-01-17 00:17:34
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yelon315

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2015-01-18 16:51:14
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