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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 关于PCR反应液纯化回收后再电泳的问题
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音四1990

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于PCR反应液纯化回收后再电泳的问题 已有2人参与

如题 我跑RACE 每一次PCR的反应液用TAKARA miniBEST 的纯化Kit回收
回收之后的溶液和后续的巢式PCR产物一起跑电泳 这样才能对比结果
可是每次在加样的时候就发现 回收产物取5ul与1ul 6X Loading Buffer混合后加样 混合液沉降不下去 会随着枪头的拔出被提到加样孔外面 然后很快就扩散到TAE里面消失掉了
因为之前没做过回收产物的电泳 不知道问题出在哪里 是要用别的BUFFER呢还是溶液需要稀释？
有的能沉降下去有的不能……
各路大神快来救命吧……

因为小生只有6个金币……所以只能付出全副身家了！大神们 救人一命胜造七级浮屠啊！！
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我没那种命啊轮也不会轮到我
1楼 2014-03-09 09:38:47
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-03-31 16:20:45
1、注意自己点样的方法，一般不会漂出去的，或者你可以再多加点Loading Buffer，也许你切胶回收后不是用灭菌水溶解样品也有影响
2、切胶回收的产物一般需要加大点样量，5uL一般看不出什么结果吧？你可以增加PCR体系的量，拿这个剩下的产物进行比较
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
2楼2014-03-09 10:44:30
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音四1990

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-09 10:44:30
1、注意自己点样的方法，一般不会漂出去的，或者你可以再多加点Loading Buffer，也许你切胶回收后不是用灭菌水溶解样品也有影响
2、切胶回收的产物一般需要加大点样量，5uL一般看不出什么结果吧？你可以增加PCR体系 ...

不是切胶回收 是直接纯化PCR反应液 洗脱用的是试剂盒里的Elution Buffer 会不会是因为这个的原因……
之前一次纯化用的灭菌水 但上样是还是不对
加到孔里之后总要逸散掉一部分 跑出来的也是歪歪扭扭的
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我没那种命啊轮也不会轮到我
3楼2014-03-09 11:55:23
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
音四1990: 金币+6, ★★★★★最佳答案, 仔细回想我好像在洗脱之前没有再离心一次……下次在试试 2014-03-09 16:23:35
样品上浮九成因为里面混有乙醇。
先检查你的试剂有无问题：分别用Elution Buffer 和灭菌水 加Loading Buffer后点样，看是否快速下沉。
经上步确认后，真相只能是你回收时没有清除干净乙醇。
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4楼2014-03-09 12:20:32
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 音四1990 at 2014-03-09 11:55:23
不是切胶回收 是直接纯化PCR反应液 洗脱用的是试剂盒里的Elution Buffer 会不会是因为这个的原因……
之前一次纯化用的灭菌水 但上样是还是不对
加到孔里之后总要逸散掉一部分 跑出来的也是歪歪扭扭的...

呃，我没这么做过，着实有点不清楚，问问楼下的高手
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植根于内心的修养；无需提醒的自觉；以约束为前提的自由；为别人着想的善良
5楼2014-03-09 13:04:03
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音四1990

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by XOooZzz at 2014-03-09 12:20:32
样品上浮九成因为里面混有乙醇。
先检查你的试剂有无问题：分别用Elution Buffer 和灭菌水 加Loading Buffer后点样，看是否快速下沉。
经上步确认后，真相只能是你回收时没有清除干净乙醇。

多谢大神！
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我没那种命啊轮也不会轮到我
6楼2014-03-09 16:19:25
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音四1990

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 西门吹雪170 at 2014-03-09 13:04:03
呃，我没这么做过，着实有点不清楚，问问楼下的高手...

OK！多谢大神！！！
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我没那种命啊轮也不会轮到我
7楼2014-03-09 16:22:22
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