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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 连接转化后提质粒做酶切，可以切出带，做质粒PCR却P不出来，为什么？？？
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)

[求助] 连接转化后提质粒做酶切，可以切出带，做质粒PCR却P不出来，为什么？？？ 已有10人参与

质粒是PCM351，连接转化后挑菌落提质粒，然后做酶切跑胶，可以很明显的看到切下的条带，大小也正确，但用质粒做PCR后却跑不出条带，，这是什么原因啊，快疯了。
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1楼 2014-10-20 15:28:18
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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我就是保哥哥: 金币+2, ★有帮助 2014-10-23 16:28:49
楼主，PCR体系没看到你加的酶
首先你分析一下载体的酶切位点，然后PCR时有个阳性对照，酶切设阴性对照了吗？
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13楼2014-10-23 11:19:38
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灰血动物

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我就是保哥哥: 金币+2, ★有帮助 2014-10-23 16:28:21
楼主 是这样的
酶切的可信度大于PCR，小于测序

你可以送几个样品去测序

另外 你说你P不出来并列出了体系 但是并没有详细说明的引物的位置信息等

你有没有将连接前的“空质粒”作为对照呢？
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未完成
14楼2014-10-23 15:27:03
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普通回帖

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
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我就是保哥哥: 金币+2, ★有帮助 2014-10-20 15:53:04
我也遇到过相同的情况，可以切出来，但是PCR的时候没有条带···我之所以做PCR，是因为我酶切之后的片段比预想的片段少大概1000bp，所以想用PCR鉴定一下，但没有P出来···个人认为酶切比PCR靠谱···
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···
2楼2014-10-20 15:51:42
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小冀- at 2014-10-20 15:51:42
我也遇到过相同的情况，可以切出来，但是PCR的时候没有条带···我之所以做PCR，是因为我酶切之后的片段比预想的片段少大概1000bp，所以想用PCR鉴定一下，但没有P出来···个人认为酶切比PCR靠谱···

我是转化后挑了16个菌落做菌落PCR，但是P不出来或者非常非常模糊，所以我直接提质粒酶切了，奇怪的是酶切的16个样本都切出来了，就是说我的连接效率是100%，所以这个概率太高了，才做的质粒PCR，结果一个没有P出来。一般来说质粒PCR有结果，酶切没结果是可疑的；但我的酶切有结果，质粒ＰＣＲ却没结果，这个是为什么呢，我想不通呀，，，压力好大
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3楼2014-10-20 15:58:08
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谢铮

至尊木虫 (著名写手)

爱分子爱实验
请问你用的是什么引物？
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博学好友张弛有度
4楼2014-10-20 16:33:50
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 我就是保哥哥 at 2014-10-20 15:58:08
我是转化后挑了16个菌落做菌落PCR，但是P不出来或者非常非常模糊，所以我直接提质粒酶切了，奇怪的是酶切的16个样本都切出来了，就是说我的连接效率是100%，所以这个概率太高了，才做的质粒PCR，结果一个没有P出来 ...

我一直用的是酶切鉴定的，我想只要片段对就应该是OK的吧，只是我切出来之后片段少了1000，所以我才做的PCR
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···
5楼2014-10-20 16:44:16
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 谢铮 at 2014-10-20 16:33:50
请问你用的是什么引物？

引物是之前设计好的引物，之前单纯的做ＰＣＲ是没有问题的，这个应该不是问题，我都做了两个月了，不知道这次到底连上了没有，烦死人啦
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6楼2014-10-20 16:44:36
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小冀- at 2014-10-20 16:44:16
我一直用的是酶切鉴定的，我想只要片段对就应该是OK的吧，只是我切出来之后片段少了1000，所以我才做的PCR...

我酶切的片段大小没有问题，关键是１６个样全有带，这个可疑，老师说这个问题比较大，不可能挑了１６个就全是连接上的，如果有几个没有带的话，说明没有问题，我真的不知道怎么办了，，，
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7楼2014-10-20 16:49:11
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2007090351

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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你质粒PCR的模板加的是多少？
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8楼2014-10-20 21:50:59
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海之草

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
片段很长吗？质粒正反测个序就知道什么情况了。
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9楼2014-10-21 12:38:22
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 2007090351 at 2014-10-20 21:50:59
你质粒PCR的模板加的是多少？

20ｕｌ体系，ｂｕｆｆｅｒ１０，引物Ｆ１ｕｌ，引物Ｒ１ｕｌ，质粒１ｕｌ，水７ｕｌ，这应该没有问题
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10楼2014-10-21 21:15:51
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