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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

[交流] 质粒快抽有条带，提取时却没有了，什么问题啊？

如题，最近试验转化大肠杆菌E.Coli   DH5α，氨苄抗性，做质粒快抽时有条带，而且条带还很亮的，可是扩培（加入抗生素）后，却提不出质粒来，半点条带都没有，请教各位高手到底是什么原因？？？？？
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1楼 2013-01-16 16:39:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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能确定快抽时的条带是目的质粒吗？快抽时看到的亮的条带不会是RNA吧。
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3楼2013-01-17 08:53:00
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-17 08:53:00
能确定快抽时的条带是目的质粒吗？快抽时看到的亮的条带不会是RNA吧。

呃？可是只有一条带的啊，RNA不止一条带的，而且RNA很容易降解的，提取基因组时也是最下面一团的，这个真的是一条亮带的哦。。。。你们快抽时使用的什么方法呢？可以确定跑出来的是什么东西么？
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4楼2013-01-17 09:03:14
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-17 08:53:00
能确定快抽时的条带是目的质粒吗？快抽时看到的亮的条带不会是RNA吧。

呃？RNA不是一条带的吧，它不会降解的么？你们快抽使用的什么方法呢？可以确定跑出来的是什么东西吗？
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5楼2013-01-17 09:04:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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piaoyunokok: 金币+1, 谢谢 2013-01-18 10:07:39
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5楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-01-17 09:04:36
呃？RNA不是一条带的吧，它不会降解的么？你们快抽使用的什么方法呢？可以确定跑出来的是什么东西吗？...

我用的是酚：氯仿：异戊醇震荡。抽出来的东西什么都有的。电泳跑长一点可以分辨清楚。能看到基因组DNA、质粒和下面的几条RNA。RNA在新鲜裂解的样品中很亮的。因为不太喜欢用酚，现在我常用菌落PCR。
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6楼2013-01-17 10:31:40
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-17 10:31:40
我用的是酚：氯仿：异戊醇震荡。抽出来的东西什么都有的。电泳跑长一点可以分辨清楚。能看到基因组DNA、质粒和下面的几条RNA。RNA在新鲜裂解的样品中很亮的。因为不太喜欢用酚，现在我常用菌落PCR。...

好吧，我再试一下菌落PCR。谢谢
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7楼2013-01-18 10:07:29
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-17 10:31:40
我用的是酚：氯仿：异戊醇震荡。抽出来的东西什么都有的。电泳跑长一点可以分辨清楚。能看到基因组DNA、质粒和下面的几条RNA。RNA在新鲜裂解的样品中很亮的。因为不太喜欢用酚，现在我常用菌落PCR。...

菌落PCR电泳为什么会有好多条带啊？比那个MARKER条带还要多，虽说那个目的条带也有，但这种情况确实不能确定就是啊。。。。
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8楼2013-01-22 15:17:27
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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8楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-01-22 15:17:27
菌落PCR电泳为什么会有好多条带啊？比那个MARKER条带还要多，虽说那个目的条带也有，但这种情况确实不能确定就是啊。。。。...

菌落PCR因为模板比较脏，的确可能会出现多条带的问题。主要是注意不要弄太多菌造成模板量过大。我一般是用无菌枪头挑单菌落，先在一块LB板上备份菌落，然后在PCR管底部搅若干下就可以了。
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9楼2013-01-22 15:24:10
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-22 15:24:10
菌落PCR因为模板比较脏，的确可能会出现多条带的问题。主要是注意不要弄太多菌造成模板量过大。我一般是用无菌枪头挑单菌落，先在一块LB板上备份菌落，然后在PCR管底部搅若干下就可以了。...

呃？我的是菌液，就直接取了2微升的菌液，稀释10倍后，取稀释液1微升做的PCR。这个还算不算浓啊？
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10楼2013-01-24 09:45:32
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
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piaoyunokok: 金币+1, 谢谢 2013-01-24 15:35:36
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10楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-01-24 09:45:32
呃？我的是菌液，就直接取了2微升的菌液，稀释10倍后，取稀释液1微升做的PCR。这个还算不算浓啊？...

肯定是太多啦，菌液的话摇4个小时就可以拿来P了。我一般用单克隆在PCR反应液里搅一搅。
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11楼2013-01-24 12:01:38
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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11楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-24 12:01:38
肯定是太多啦，菌液的话摇4个小时就可以拿来P了。我一般用单克隆在PCR反应液里搅一搅。...

。。。。。。搅一搅就直接用了么？搅在多大体系里面了啊？
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12楼2013-01-24 15:39:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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12楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-01-24 15:39:39
。。。。。。搅一搅就直接用了么？搅在多大体系里面了啊？...

检测一般不需要大体积，我一般做20μl，10μl也是可以的。
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13楼2013-01-24 15:43:51
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dazhen9527

新虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-01-22 15:17:27
菌落PCR电泳为什么会有好多条带啊？比那个MARKER条带还要多，虽说那个目的条带也有，但这种情况确实不能确定就是啊。。。。...

提高退火温度，延长引物长度
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14楼2014-04-13 19:24:39
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dazhen9527

新虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-01-17 09:03:14
呃？可是只有一条带的啊，RNA不止一条带的，而且RNA很容易降解的，提取基因组时也是最下面一团的，这个真的是一条亮带的哦。。。。你们快抽时使用的什么方法呢？可以确定跑出来的是什么东西么？...

你那条亮带应该是基因组，快抽质粒一般两到三条带
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15楼2014-04-13 19:26:10
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Neo2000

木虫 (著名写手)
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15楼: Originally posted by dazhen9527 at 2014-04-13 19:26:10
你那条亮带应该是基因组，快抽质粒一般两到三条带...

用试剂盒抽质粒也不贵啊，何不试试，国产的就挺好

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16楼2014-04-13 19:50:39
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yingying15882楼
2013-01-16 19:33   回复  
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