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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 连接转化后提质粒做酶切，可以切出带，做质粒PCR却P不出来，为什么？？？
汕头大学海洋科学接受调剂
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 海之草 at 2014-10-21 12:38:22
片段很长吗？质粒正反测个序就知道什么情况了。

去测序了已经，估计又失败；　
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11楼2014-10-21 21:16:18
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流氓一个

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们实验室也有酶切验证正确，PCR验证没有P出条带的，目前还没解决，准备再PCR一次看看
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我有我人生
12楼2014-10-23 10:58:44
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我就是保哥哥: 金币+2, ★有帮助 2014-10-23 16:28:49
楼主，PCR体系没看到你加的酶
首先你分析一下载体的酶切位点，然后PCR时有个阳性对照，酶切设阴性对照了吗？
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13楼2014-10-23 11:19:38
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灰血动物

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我就是保哥哥: 金币+2, ★有帮助 2014-10-23 16:28:21
楼主 是这样的
酶切的可信度大于PCR，小于测序

你可以送几个样品去测序

另外 你说你P不出来并列出了体系 但是并没有详细说明的引物的位置信息等

你有没有将连接前的“空质粒”作为对照呢？
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未完成
14楼2014-10-23 15:27:03
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 流氓一个 at 2014-10-23 10:58:44
我们实验室也有酶切验证正确，PCR验证没有P出条带的，目前还没解决，准备再PCR一次看看

你们酶切验证切下带的概率大吗
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15楼2014-10-23 16:26:58
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 灰血动物 at 2014-10-23 15:27:03
楼主 是这样的
酶切的可信度大于PCR，小于测序

你可以送几个样品去测序

另外 你说你P不出来并列出了体系 但是并没有详细说明的引物的位置信息等

你有没有将连接前的“空质粒”作为对照呢？

哈哈哈，这个我后来做了，空质粒也切下带了，晕晕晕，，，是不是被污染了？
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16楼2014-10-23 16:28:07
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灰血动物

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 我就是保哥哥 at 2014-10-23 16:28:07
哈哈哈，这个我后来做了，空质粒也切下带了，晕晕晕，，，是不是被污染了？...

空质粒的带跟你挑的克隆比大小如何。。。
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未完成
17楼2014-10-24 09:42:38
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流氓一个

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 我就是保哥哥 at 2014-10-23 16:26:58
你们酶切验证切下带的概率大吗...

不大
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我有我人生
18楼2014-10-24 15:00:52
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 灰血动物 at 2014-10-24 09:42:38
空质粒的带跟你挑的克隆比大小如何。。。...

空质粒的带肯定跑的快一些
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19楼2014-10-24 16:20:39
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sunlk

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
我就是保哥哥(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:37:11
首先：为什么不直接送一个测序？
其次，质粒做模板的时候，量太大的话是扩不出条带的。一般是50ul体系的话质粒浓度20ng作用。加的多是扩不出。做PCR之前模板是需要测浓度的。不是说加多少微升。
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很给力
20楼2014-10-24 16:31:32
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