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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 连接转化后提质粒做酶切，可以切出带，做质粒PCR却P不出来，为什么？？？
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)

[求助] 连接转化后提质粒做酶切，可以切出带，做质粒PCR却P不出来，为什么？？？ 已有10人参与

质粒是PCM351，连接转化后挑菌落提质粒，然后做酶切跑胶，可以很明显的看到切下的条带，大小也正确，但用质粒做PCR后却跑不出条带，，这是什么原因啊，快疯了。
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1楼 2014-10-20 15:28:18
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sunlk

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
我就是保哥哥(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:37:11
首先：为什么不直接送一个测序？
其次，质粒做模板的时候，量太大的话是扩不出条带的。一般是50ul体系的话质粒浓度20ng作用。加的多是扩不出。做PCR之前模板是需要测浓度的。不是说加多少微升。
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很给力
20楼2014-10-24 16:31:32
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查看全部 23 个回答

小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
我就是保哥哥: 金币+2, ★有帮助 2014-10-20 15:53:04
我也遇到过相同的情况，可以切出来，但是PCR的时候没有条带···我之所以做PCR，是因为我酶切之后的片段比预想的片段少大概1000bp，所以想用PCR鉴定一下，但没有P出来···个人认为酶切比PCR靠谱···
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···
2楼2014-10-20 15:51:42
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我就是保哥哥

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小冀- at 2014-10-20 15:51:42
我也遇到过相同的情况，可以切出来，但是PCR的时候没有条带···我之所以做PCR，是因为我酶切之后的片段比预想的片段少大概1000bp，所以想用PCR鉴定一下，但没有P出来···个人认为酶切比PCR靠谱···

我是转化后挑了16个菌落做菌落PCR，但是P不出来或者非常非常模糊，所以我直接提质粒酶切了，奇怪的是酶切的16个样本都切出来了，就是说我的连接效率是100%，所以这个概率太高了，才做的质粒PCR，结果一个没有P出来。一般来说质粒PCR有结果，酶切没结果是可疑的；但我的酶切有结果，质粒ＰＣＲ却没结果，这个是为什么呢，我想不通呀，，，压力好大
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3楼2014-10-20 15:58:08
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谢铮

至尊木虫 (著名写手)

爱分子爱实验
请问你用的是什么引物？
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博学好友张弛有度
4楼2014-10-20 16:33:50
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