| 查看: 1165 | 回复: 3 | |||
[求助]
7kb质粒定点突变PCR检测无产物还要继续做下去吗 已有3人参与
|
|
环化PCR定点突变质粒，大小为7kb的质粒，设计的引物28bp，引物GC含量为65%，质粒GC含量为53%，PCR扩增分别设置了25个循环和30个循环都做过，总共50ul体系，取5ul进行检测，结果都看不到目的条带，还需要往后用Dpn1处理吗？ 这个PCR过程耗时好长的说，试过几次了，都没目的条带，要崩溃了…… ……求各位有经验的前辈指点迷津啊！ 万谢！ |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 PCR疑难解答 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有236人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 质粒是PCR产物，片段是磷酸化的，易自连，求连接体系中二者的比例，希望高手指点
已经有10人回复
- 我做质粒扩增诱变pcr 结果正确，但是转化进入感受态不长菌，为何？
已经有3人回复
- 用试剂盒通过全质粒PCR来做定点突变，导入不了感受态细胞，请帮我走出困境！
已经有8人回复
- 以质粒为模板做pcr时要不要稀释？
已经有5人回复
- 急救！cDNA做模板进行PCR克隆出的质粒测出了一段内含子
已经有4人回复
- 质粒测序 pcr产物ta克隆后送去测序 为什么要测双向
已经有6人回复
- 请问做普通PCR要用多大浓度的DNA?
已经有14人回复
- 质粒上定点突变不用DpnI酶消化的后果
已经有16人回复
- 试剂盒提取细菌DNA后，跑胶检测有条带，但是PCR后却无扩增产物。
已经有10人回复
- 菌液pcr出来后，质粒提不出，测序老失败？
已经有6人回复
- 急!要连表达载体的目的片段可以是PCR后回收的产物吗？已经连中间载体验证过了
已经有3人回复
- DNA电泳检测效果不好，可以用来做SRAP-PCR么。
已经有13人回复
- 高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
已经有26人回复
- 求全质粒定点突变高手解疑问
已经有16人回复
- pcr产物测序和克隆之后重组质粒测序结果一样吗？
已经有12人回复
- 请问做实时定量PCR前检测RNA或DNA含量的仪器叫什么
已经有4人回复
- 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体
已经有26人回复
- 【求助/交流】质粒PCR产物的回收（质粒构建）
已经有11人回复
- 【求助/交流】做连接后的质粒是否可以用来做pcr
已经有10人回复
- 【求助/交流】连接产物转化后菌落PCR正确，提取的质粒却比空质粒还小？
已经有4人回复
- 【求助/交流】做过大引物全质粒PCR的进来看
已经有29人回复
- 【求助/交流】定点突变PCR后加DPN1酶的作用
已经有4人回复
- 【求助/交流】PCR产物与T载体的连接的实验原理？
已经有5人回复
xuanyalizi
铁虫 (小有名气)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 50.2
- 帖子: 74
- 在线: 14.9小时
- 虫号: 965770
- 注册: 2010-03-09
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-07 10:06:03
感谢参与，应助指数 +1
艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-07 10:06:03
| 既然没有条带肯定是没有P出来呀，那根本就没有再用DpnI处理的必要了。可以尝试改变的条件：1）降低退火温度，如果什么都没有，就先降低，2）质粒模板的量不要太高，20ng足够，3）用不同的酶去试一下，7k的产物估计至少要3-4小时，有些酶失活了，可选择一些长片段扩增的酶，4）再重新设计一两对新的引物，5) 可以尝试添加一些PCR 添加剂，类似DMSO/Betaine之类的东西。多试一下不同的条件，质粒应该相对来说比较好P的，只是片段长了，选择1个活性高点的酶，尝试几个退火温度，怕浪费时间可以一次多摸索几个条件，多试几个条件应该没问题的。 |
2楼2014-06-07 07:45:26
grase 
捐助贵宾 (职业作家)
- 应助: 32 (小学生)
- 金币: 2011.7
- 散金: 1226
- 红花: 42
- 帖子: 3873
- 在线: 63小时
- 虫号: 826670
- 注册: 2009-08-12
- 性别: MM
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
3楼2014-06-07 08:36:58
huangrui1988 
铜虫 (小有名气)
- 应助: 73 (初中生)
- 金币: 1727.8
- 散金: 20
- 红花: 2
- 帖子: 201
- 在线: 210.1小时
- 虫号: 953497
- 注册: 2010-02-07
- 专业: 微生物资源与分类学
4楼2014-06-07 09:13:02
50