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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 7kb质粒定点突变PCR检测无产物还要继续做下去吗
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艰苦温度

新虫 (小有名气)

[求助] 7kb质粒定点突变PCR检测无产物还要继续做下去吗已有3人参与

环化PCR定点突变质粒，大小为7kb的质粒，设计的引物28bp，引物GC含量为65%，质粒GC含量为53%，PCR扩增分别设置了25个循环和30个循环都做过，总共50ul体系，取5ul进行检测，结果都看不到目的条带，还需要往后用Dpn1处理吗？

   这个PCR过程耗时好长的说，试过几次了，都没目的条带，要崩溃了……
     ……求各位有经验的前辈指点迷津啊！

   万谢！
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1楼2014-06-06 23:49:04
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xuanyalizi

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-07 10:06:03
既然没有条带肯定是没有P出来呀，那根本就没有再用DpnI处理的必要了。可以尝试改变的条件：1）降低退火温度，如果什么都没有，就先降低，2）质粒模板的量不要太高，20ng足够，3）用不同的酶去试一下，7k的产物估计至少要3-4小时，有些酶失活了，可选择一些长片段扩增的酶，4）再重新设计一两对新的引物，5) 可以尝试添加一些PCR 添加剂，类似DMSO/Betaine之类的东西。多试一下不同的条件，质粒应该相对来说比较好P的，只是片段长了，选择1个活性高点的酶，尝试几个退火温度，怕浪费时间可以一次多摸索几个条件，多试几个条件应该没问题的。
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闲适恬淡，宠辱不惊
2楼2014-06-07 07:45:26
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grase

捐助贵宾 (职业作家)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
感谢参与，应助指数 +1
引物再设计长一些就OK了。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-06-07 08:36:58
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
艰苦温度(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-07 10:06:19
1 即使你P出来了，不加dpnI是不行的。2 PCR条件再调节一下，不然也不用做了。
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4楼2014-06-07 09:13:02
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