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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒上定点突变不用DpnI酶消化的后果
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echochen1017

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒上定点突变不用DpnI酶消化的后果

本人在已构建成功的重组质粒上定点突变，但没有使用消化酶，直接转化，有转化子，提质粒，测序，却发现在设计好的位点没有发生突变，想交流一下，是否跟消化酶有关，想知道整个详细的PCR过程和转化后在质粒模板和PCR产物在宿主菌中复制克隆的效率。谢谢啦~~~
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1楼 2013-07-17 09:40:53
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
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echochen1017: 金币+1 2013-07-17 11:46:26
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 11:53:59
DpnI酶是要消化掉模板质粒。如果没有做消化直接转化，当然有可能没有突变啦。质粒的转化效率非常高，如果没有消化掉模板，你得到的克隆基本上应该都是原质粒。
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2楼2013-07-17 09:48:30
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-21 08:12:07
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5楼: Originally posted by echochen1017 at 2013-07-17 10:26:10
这个有文献支撑或数据支撑么？...

这是有的啊，模板质粒带有甲基化（质粒需从dam,dcm非缺陷型的大肠杆菌菌株中提取，比如DH5a），PCR产生的DNA链不带甲基化，DpnI的一个特性就是要其识别位点被甲基化后其才能切割DNA，这样就把环状DNA链和新和成的PCR产物链给区分开了，其只降解质粒DNA链，不降解PCR产物链,经过转化，PCR产物链经过修复形成环状，从而完成突变
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10楼2013-07-18 23:07:07
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gyesang

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-21 08:12:13
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4楼: Originally posted by echochen1017 at 2013-07-17 10:12:17
转的是DH5α，最后的质粒里突变的产物能占多少呢？...

比如起始质粒模板量为n,你的PCR循环为30个的话，那么最后的质粒里突变的产物占多少呢？告诉你，突变的产物为30n，是模板质粒的30倍，而不是n^30，因为其是线性扩增而不是指数扩增，至于为什么，你可以在纸上比划比划
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11楼2013-07-18 23:10:06
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pyphappy

新虫 (初入文坛)
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需要用消化酶消化后再转化
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13楼2013-10-28 15:13:57
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huanghznd

金虫 (小有名气)
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用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。
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3楼2013-07-17 10:06:55
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 10:06:55
用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。

转的是DH5α，最后的质粒里突变的产物能占多少呢？
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4楼2013-07-17 10:12:17
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-17 09:48:30
DpnI酶是要消化掉模板质粒。如果没有做消化直接转化，当然有可能没有突变啦。质粒的转化效率非常高，如果没有消化掉模板，你得到的克隆基本上应该都是原质粒。

这个有文献支撑或数据支撑么？
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5楼2013-07-17 10:26:10
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huanghznd

金虫 (小有名气)
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echochen1017(gyesang代发): 金币+1, 呵呵！的确是跟零无限趋近 2013-07-18 23:10:52
转DH5α的话，正确率基本为0
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6楼2013-07-17 10:34:13
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huanghznd

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echochen1017(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-19 00:03:58
DH5α没有甲基化酶消化原始模板，转DMT的话可以消化原始的甲基化模板，当然体外用DpnIi消化是双保险。
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7楼2013-07-17 10:36:25
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shanqian1988

铜虫 (小有名气)
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echochen1017: 金币+1 2013-07-17 11:45:45
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-19 00:04:51
一般用DpnI消化后转化长出来还有20%-30%是你的原始模板呢，所以如果不消化，结果真的很不理想的
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8楼2013-07-17 11:06:30
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by shanqian1988 at 2013-07-17 11:06:30
一般用DpnI消化后转化长出来还有20%-30%是你的原始模板呢，所以如果不消化，结果真的很不理想的

有相关文献或资料吗？能给我看一下吗？
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9楼2013-07-17 11:46:14
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yunlongma

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11楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-18 23:10:06
比如起始质粒模板量为n,你的PCR循环为30个的话，那么最后的质粒里突变的产物占多少呢？告诉你，突变的产物为30n，是模板质粒的30倍，而不是n^30，因为其是线性扩增而不是指数扩增，至于为什么，你可以在纸上比划比 ...

请问，以构建好的质粒为模板，用quikchange法进行定点突变，为什么是线性扩增而不是指数扩增，我还是没有想明白……
是因为pcr产物含有staggered nick，而不能作为模板吗？

还有得到的pcr产物是环状而且带有sraggered nick吗？
还是说，得到的pcr产物是线性的？

谢谢！！
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12楼2013-10-04 11:12:48
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新虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 10:06:55
用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。

体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒的大肠杆菌（DMT）降解，
而去甲基化扩增产物不会被降解。
体外降解：甲基化模板可被Dpn1识别、切割，而去甲基化扩增产物不会被降解。
筛选依据：来自大肠杆菌的质粒99％发生甲基化；PCR产物是去甲基化的产物。
问题是：PCR产物在体内甲基化之后不会被DMT降解吗？？还有原始质粒就是甲基化的啊 在体内不会被降解吗？其实是一个问题，搞不懂啊！！还有，什么是DMT啊？
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14楼2014-05-20 13:38:26
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imsmiler

新虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by yunlongma at 2013-10-04 11:12:48
请问，以构建好的质粒为模板，用quikchange法进行定点突变，为什么是线性扩增而不是指数扩增，我还是没有想明白……
是因为pcr产物含有staggered nick，而不能作为模板吗？

还有得到的pcr产物是环状而且带有sr ...

模板只能是最初的质粒，后来扩增出来的有nick的不能作为模板吧。普通PCR，模板是越来越多的。这种突变法pcr模板数量是不变的，所以是线性扩增。
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15楼2014-08-09 16:15:34
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)
DMT是不是jm110

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16楼2014-08-09 18:19:29
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不要Dpn I酶简直就是技术的倒退
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17楼2014-08-12 15:28:42
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