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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DpnI 酶消化不了模板，求解。
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mjzjily

铜虫 (初入文坛)

[求助] DpnI 酶消化不了模板，求解。

我最近用PCR扩增的方法扩增线性化质粒，扩增之后用DpnI消化模板。但是构建后依然有很多的假阳性，说明DpnI酶没有起作用。我的质粒是用DH5α扩增的。之前也试过将质粒线性化后再PCR，但多次试验发现不可行。主要问题就是为什么DpnI酶没有起作用？另外，我现在也计划先将质粒甲基化酶处理再做PCR后，在用DpnI酶消化，不知道哪些甲基化酶比较好？谢谢各位！
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扎实科研
1楼 2013-01-23 11:36:36
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-23 18:55:48
mjzjily: 金币+1 2013-01-25 14:17:07
DpnI酶的碱基识别序列要甲基化才能被切开，PCR产物没有被甲基化吧？

不知道你的DpnI位点在产物的什么部分，如果你设计引物时加入的酶切位点，那么就有一个末端酶切效率（酶切位点在末端是，很多酶的酶切效率会很低）的问题，建议在引物设计时除了加入酶切位点外，末端再加入两个左右的碱基，以提高酶切效率。
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2楼2013-01-23 16:18:26
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greenygreen

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mjzjily: 金币+2 2013-01-25 14:17:18
你所说的消化模版，是指要消化PCR反应中加入的质粒DNA模版么？那应该完全没有问题。因为DH5a菌株提出的质粒本身就是带有甲基化位点的，完全可以被消化。这也是基于PCR-DpnI消化法制备突变质粒的原理。而且假阳性不代表完全没有被消化，这与模版的量以及酶的活性有关。应多挑些验证或者确认酶的活性。
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3楼2013-01-23 20:12:20
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
你有做对照吗，没加dpnI的假阳性率和加了的，不然你怎么能确定没发挥作用
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4楼2013-01-23 21:54:40
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0405lanfeng

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mjzjily: 金币+3 2013-01-25 14:17:52
我前几天做定点突变 用的NEB的 Dpn1，效果还不错。你说的先消化后扩增，我觉得不行，这样很可能把你要的片段都给切断的。还有，消化的时间可以延长，protocol 说一两个小时就够了 不过我至少五个小时 还有次是过夜的。各人认为消化久了好~

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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5楼2013-01-24 07:54:06
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mjzjily

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yesali at 2013-01-23 16:18:26
DpnI酶的碱基识别序列要甲基化才能被切开，PCR产物没有被甲基化吧？

不知道你的DpnI位点在产物的什么部分，如果你设计引物时加入的酶切位点，那么就有一个末端酶切效率（酶切位点在末端是，很多酶的酶切效率会很 ...

你好，我用DpnI酶消化的目的是为了消除PCR体系中的模板，以免在之后的转化中出现假阳性，干扰筛选。所以不涉及到保护碱基的问题。谢谢
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扎实科研
6楼2013-01-25 14:12:23
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mjzjily

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-01-23 21:54:40
你有做对照吗，没加dpnI的假阳性率和加了的，不然你怎么能确定没发挥作用

因为所用的DpnI酶是新订的，没考虑这个酶失效的问题。感谢你的提醒，我试一下。
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扎实科研
7楼2013-01-25 14:13:18
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mjzjily

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by greenygreen at 2013-01-23 20:12:20
你所说的消化模版，是指要消化PCR反应中加入的质粒DNA模版么？那应该完全没有问题。因为DH5a菌株提出的质粒本身就是带有甲基化位点的，完全可以被消化。这也是基于PCR-DpnI消化法制备突变质粒的原理。而且假阳性不代 ...

好的，准备试一下DpnI酶的活性，那请问，您之前使用DpnI酶时候，感觉DpnI酶的活性如何，能完成或者大部分消除模板质粒吗
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扎实科研
8楼2013-01-25 14:15:12
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mjzjily

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 0405lanfeng at 2013-01-24 07:54:06
我前几天做定点突变 用的NEB的 Dpn1，效果还不错。你说的先消化后扩增，我觉得不行，这样很可能把你要的片段都给切断的。还有，消化的时间可以延长，protocol 说一两个小时就够了 不过我至少五个小时 还有次是过夜的 ...

谢谢，我之前消化了2个小时左右，看来有点高估它的活性了，我再试试。
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扎实科研
9楼2013-01-25 14:16:26
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greenygreen

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by mjzjily at 2013-01-25 14:15:12
好的，准备试一下DpnI酶的活性，那请问，您之前使用DpnI酶时候，感觉DpnI酶的活性如何，能完成或者大部分消除模板质粒吗...

37度消化两个小时，基本能够消除模版质粒。转化之后挑单克隆测序，挑了五个有四个阳性，突变成功。
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10楼2013-01-26 19:09:55
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