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mjzjily

铜虫 (初入文坛)

[求助] DpnI 酶消化不了模板,求解。

我最近用PCR扩增的方法扩增线性化质粒,扩增之后用DpnI消化模板。但是构建后依然有很多的假阳性,说明DpnI酶没有起作用。我的质粒是用DH5α扩增的。之前也试过将质粒线性化后再PCR,但多次试验发现不可行。主要问题就是为什么DpnI酶没有起作用?另外,我现在也计划先将质粒甲基化酶处理再做PCR后,在用DpnI酶消化,不知道哪些甲基化酶比较好?谢谢各位!
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扎实科研
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0405lanfeng

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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mjzjily: 金币+3 2013-01-25 14:17:52
我前几天做定点突变 用的NEB的 Dpn1,效果还不错。你说的先消化后扩增,我觉得不行,这样很可能把你要的片段都给切断的。还有,消化的时间可以延长,protocol 说一两个小时就够了 不过我至少五个小时 还有次是过夜的。各人认为消化久了好~

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2013-01-24 07:54:06
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+4, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-23 18:55:48
mjzjily: 金币+1 2013-01-25 14:17:07
DpnI酶的碱基识别序列要甲基化才能被切开,PCR产物没有被甲基化吧?

不知道你的DpnI位点在产物的什么部分,如果你设计引物时加入的酶切位点,那么就有一个末端酶切效率(酶切位点在末端是,很多酶的酶切效率会很低)的问题,建议在引物设计时除了加入酶切位点外,末端再加入两个左右的碱基,以提高酶切效率。
2楼2013-01-23 16:18:26
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greenygreen

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
mjzjily: 金币+2 2013-01-25 14:17:18
你所说的消化模版,是指要消化PCR反应中加入的质粒DNA模版么?那应该完全没有问题。因为DH5a菌株提出的质粒本身就是带有甲基化位点的,完全可以被消化。这也是基于PCR-DpnI消化法制备突变质粒的原理。而且假阳性不代表完全没有被消化,这与模版的量以及酶的活性有关。应多挑些验证或者确认酶的活性。
3楼2013-01-23 20:12:20
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

你有做对照吗,没加dpnI的假阳性率和加了的,不然你怎么能确定没发挥作用
4楼2013-01-23 21:54:40
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