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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒上定点突变不用DpnI酶消化的后果
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echochen1017

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒上定点突变不用DpnI酶消化的后果

本人在已构建成功的重组质粒上定点突变，但没有使用消化酶，直接转化，有转化子，提质粒，测序，却发现在设计好的位点没有发生突变，想交流一下，是否跟消化酶有关，想知道整个详细的PCR过程和转化后在质粒模板和PCR产物在宿主菌中复制克隆的效率。谢谢啦~~~
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1楼 2013-07-17 09:40:53
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★ ★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-21 08:12:07
引用回帖:
5楼: Originally posted by echochen1017 at 2013-07-17 10:26:10
这个有文献支撑或数据支撑么？...

这是有的啊，模板质粒带有甲基化（质粒需从dam,dcm非缺陷型的大肠杆菌菌株中提取，比如DH5a），PCR产生的DNA链不带甲基化，DpnI的一个特性就是要其识别位点被甲基化后其才能切割DNA，这样就把环状DNA链和新和成的PCR产物链给区分开了，其只降解质粒DNA链，不降解PCR产物链,经过转化，PCR产物链经过修复形成环状，从而完成突变
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10楼2013-07-18 23:07:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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echochen1017: 金币+1 2013-07-17 11:46:26
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 11:53:59
DpnI酶是要消化掉模板质粒。如果没有做消化直接转化，当然有可能没有突变啦。质粒的转化效率非常高，如果没有消化掉模板，你得到的克隆基本上应该都是原质粒。
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2楼2013-07-17 09:48:30
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huanghznd

金虫 (小有名气)
★
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用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。
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3楼2013-07-17 10:06:55
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 10:06:55
用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。

转的是DH5α，最后的质粒里突变的产物能占多少呢？
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4楼2013-07-17 10:12:17
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