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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒上定点突变不用DpnI酶消化的后果
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echochen1017

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒上定点突变不用DpnI酶消化的后果

本人在已构建成功的重组质粒上定点突变，但没有使用消化酶，直接转化，有转化子，提质粒，测序，却发现在设计好的位点没有发生突变，想交流一下，是否跟消化酶有关，想知道整个详细的PCR过程和转化后在质粒模板和PCR产物在宿主菌中复制克隆的效率。谢谢啦~~~
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1楼 2013-07-17 09:40:53
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yunlongma

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-18 23:10:06
比如起始质粒模板量为n,你的PCR循环为30个的话，那么最后的质粒里突变的产物占多少呢？告诉你，突变的产物为30n，是模板质粒的30倍，而不是n^30，因为其是线性扩增而不是指数扩增，至于为什么，你可以在纸上比划比 ...

请问，以构建好的质粒为模板，用quikchange法进行定点突变，为什么是线性扩增而不是指数扩增，我还是没有想明白……
是因为pcr产物含有staggered nick，而不能作为模板吗？

还有得到的pcr产物是环状而且带有sraggered nick吗？
还是说，得到的pcr产物是线性的？

谢谢！！
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12楼2013-10-04 11:12:48
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
echochen1017: 金币+1 2013-07-17 11:46:26
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 11:53:59
DpnI酶是要消化掉模板质粒。如果没有做消化直接转化，当然有可能没有突变啦。质粒的转化效率非常高，如果没有消化掉模板，你得到的克隆基本上应该都是原质粒。
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2楼2013-07-17 09:48:30
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huanghznd

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。
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3楼2013-07-17 10:06:55
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 10:06:55
用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。

转的是DH5α，最后的质粒里突变的产物能占多少呢？
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4楼2013-07-17 10:12:17
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