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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒上定点突变不用DpnI酶消化的后果
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echochen1017

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒上定点突变不用DpnI酶消化的后果

本人在已构建成功的重组质粒上定点突变，但没有使用消化酶，直接转化，有转化子，提质粒，测序，却发现在设计好的位点没有发生突变，想交流一下，是否跟消化酶有关，想知道整个详细的PCR过程和转化后在质粒模板和PCR产物在宿主菌中复制克隆的效率。谢谢啦~~~
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1楼 2013-07-17 09:40:53
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新虫 (初入文坛)
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 10:06:55
用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。

体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化质粒的大肠杆菌（DMT）降解，
而去甲基化扩增产物不会被降解。
体外降解：甲基化模板可被Dpn1识别、切割，而去甲基化扩增产物不会被降解。
筛选依据：来自大肠杆菌的质粒99％发生甲基化；PCR产物是去甲基化的产物。
问题是：PCR产物在体内甲基化之后不会被DMT降解吗？？还有原始质粒就是甲基化的啊 在体内不会被降解吗？其实是一个问题，搞不懂啊！！还有，什么是DMT啊？
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14楼2014-05-20 13:38:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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echochen1017: 金币+1 2013-07-17 11:46:26
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 11:53:59
DpnI酶是要消化掉模板质粒。如果没有做消化直接转化，当然有可能没有突变啦。质粒的转化效率非常高，如果没有消化掉模板，你得到的克隆基本上应该都是原质粒。
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2楼2013-07-17 09:48:30
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huanghznd

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。
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3楼2013-07-17 10:06:55
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echochen1017

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huanghznd at 2013-07-17 10:06:55
用DpnIi消化是一方面，但如果转大肠杆菌DMT的话，是否消化关系不大。一般正确率在99%以上。

转的是DH5α，最后的质粒里突变的产物能占多少呢？
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4楼2013-07-17 10:12:17
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