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xkzspace

新虫 (初入文坛)

[求助] 求PCR高手来啊！！！！ 已有5人参与

小弟得到一个基因，想扩展该基因的CDS序列，老是扩增补出来，求高手指教！
我的基因CDS序列是：ATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCCGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCTGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCAAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATGCCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGACAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCATTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTCTTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGA
信使RNA序列是：
GATTTCTCCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTTCCCACCGCCTCCGCCCTTCGTCGTCGTCGTCGTCGCGCATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCTGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCCGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCGAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATACCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGGCAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCTTTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTATTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGAATGCTAGACAAATTTGATGTCCTCAAATCTGTCCATGGTCTTATGTATATCATCTCTGAAGAACCTGAAAAGTCACAATCTCTGAAGGACATTGCAGCCTTCACTCTTGTACAGATGTCTGTTCCATCTGACATGTGTATCAAGTATTAGACAGAAGGAAAGGGAAACATTGCCATGTACCCAGTAGTCTAACTTATGTCTGTTAATTGGTAAATGTAGTAATGTACTCAACATGTAGGTGTAGTGCATGTCACAAACTTCATTTGATGCATTTCTGGCTCTTGCACTCCTGCTGTCTATGTGTAAAGTTCTGATATTCAGGGTACGTTTGACAAAGCTCCGGATCTTGTCTGGATCAGAAGTTTGTAAGTTAAATCGAAGTGATTTAAAATTGTACATTTCATTTAGAATAGGAACCGAATTATTCATTCAATTGTTACTGACATAATCCCTAATTCAAATCATGGATTTCTGG

CDS位于以上序列的70-1515之间。

由于GC含量特别高，所以我用了很多种酶去扩增，如pfu fly酶，phusion酶，KOD酶，这些高保证的酶都试过了，都无法扩增出目的条带（目的条带大小1446 bp）。请问该怎么扩增这段CDS啊？先谢谢了。。

求PCR高手来啊！！！！
无目的带phusion酶扩增.jpg
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1楼 2014-09-22 15:41:23
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-22 16:57:46
建议你选择GC-rich PCR Master Mix扩增试试，GC-rich sequence的扩增除了好的酶之外，buffer中的组分很关键，GC-rich buffer中含有能够降低变性温度的添加剂，比较容易扩增出目的条带
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rainwater
2楼2014-09-22 16:18:22
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:21
可以试试nest pcr，简单好用～特异性不太好～可以试试gradient，gc含量高不是问题。

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-09-22 23:03:41
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:29
GC含量高用GC buffer，再改变退火温度，跟酶没多大关系。
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4楼2014-09-23 08:46:25
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xkzspace

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-09-22 23:03:41
可以试试nest pcr，简单好用～特异性不太好～可以试试gradient，gc含量高不是问题。

巢式pcr我扩过，也是扩不出来呀
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5楼2014-09-23 12:40:46
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xkzspace

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-09-22 16:18:22
建议你选择GC-rich PCR Master Mix扩增试试，GC-rich sequence的扩增除了好的酶之外，buffer中的组分很关键，GC-rich buffer中含有能够降低变性温度的添加剂，比较容易扩增出目的条带

请问哪家公司可以买到？
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6楼2014-09-23 12:42:39
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xkzspace

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-23 08:46:25
GC含量高用GC buffer，再改变退火温度，跟酶没多大关系。

phusion酶里面有5xGC buffer，还是扩不出啊
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7楼2014-09-23 12:43:57
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yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:40
试试takara的 GC buffer。
然后延长变性的时间，
首次加5min，每次+15s，
退火时间+15s
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8楼2014-09-23 13:44:53
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

【答案】应助回帖

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xkzspace: 金币+1, how long each stup？ 2014-09-25 13:35:44
Just try 2 step
Tm of primer>60
95-->(95, 68)*35-->68-->4
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活着就要让人感受到你的存在。
9楼2014-09-23 14:57:02
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
★
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:53
引用回帖:
6楼: Originally posted by xkzspace at 2014-09-23 12:42:39
请问哪家公司可以买到？...

我们刚用过上海生工的GC-rich PCR Master Mix，产品编号为BS9284，扩增过GC%为75%的序列，扩增的效果不错，通过对你的序列分析你的是局部序列GC含量很高，可以先买1 ml试试。
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rainwater
10楼2014-09-23 15:45:55
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