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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » PCR高手请进！这个PCR 扩增条件看不懂，求高手指点！急！急！
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guoguo201209

新虫 (小有名气)

[求助] PCR高手请进！这个PCR 扩增条件看不懂，求高手指点！急！急！ 已有1人参与

我通过查文献，要扩2对长引物（6kb，9kb），扩增条件是：

92℃变性 2min
92℃变性 10sec
50℃退火 30sec 10 个循环
60℃延伸 10min
92℃变性 2min
92℃变性 10sec
50℃退火 30sec 20 个循环，每个循环加 10sec
60℃延伸 10min
60℃延伸 10min

就是后20个循环，每个循环加10S，在哪里加呀，PCR仪上能分开两部分吗？为什么第一个10个循环后，还要来一个92度预变性2min。
求高手指点，急呀！
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1楼 2014-08-30 22:00:42
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR程序可以分成几部分的，每个循环加10s也是可以设置。自己摸索一下，或者根据你们实验室PCR的品牌查说明书或者直接找售后人员询问吧。
至于中间还有一个“92度预变性2min”，也许只是作者的习惯而已。。。不过设置起来也不麻烦，没有必要去改一下。
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
2楼2014-08-31 19:54:34
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guoguo201209

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hongqifei at 2014-08-31 19:54:34
PCR程序可以分成几部分的，每个循环加10s也是可以设置。自己摸索一下，或者根据你们实验室PCR的品牌查说明书或者直接找售后人员询问吧。
至于中间还有一个“92度预变性2min”，也许只是作者的习惯而已。。。不过设 ...

再问一下楼上，每个循环加10S是总共加10S，还是说变性，退火，延伸各加10S呢?不知这是什么原理，和总共30个循环有差别吗?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-08-31 23:57:14
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hongqifei

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by guoguo201209 at 2014-08-31 23:57:14
再问一下楼上，每个循环加10S是总共加10S，还是说变性，退火，延伸各加10S呢?不知这是什么原理，和总共30个循环有差别吗?
...

一般只改变退火的条件，在这个例子中就是退火时间加10s，其他不变
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
4楼2014-09-02 21:26:32
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hongqifei

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by guoguo201209 at 2014-08-31 23:57:14
再问一下楼上，每个循环加10S是总共加10S，还是说变性，退火，延伸各加10S呢?不知这是什么原理，和总共30个循环有差别吗?
...

touchdown PCR倒是做过，每个循环降低退火温度。每个循环延长退火时间的，我也没做过。一般来说，退火时间太短可能会导致引物和模板结合不充分，退火时间增加有利于引物和模板退火，但也增加了模板两条链之间退火的概率。
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
5楼2014-09-02 21:34:18
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guoguo201209

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hongqifei at 2014-09-02 21:34:18
touchdown PCR倒是做过，每个循环降低退火温度。每个循环延长退火时间的，我也没做过。一般来说，退火时间太短可能会导致引物和模板结合不充分，退火时间增加有利于引物和模板退火，但也增加了模板两条链之间退火的 ...

感谢楼上的回复，虽然还不明白是怎么回事
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6楼2014-09-08 20:42:50
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