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guoguo201209

新虫 (小有名气)

[求助] PCR高手请进!这个PCR 扩增条件看不懂,求高手指点!急!急! 已有1人参与

我通过查文献,要扩2对长引物(6kb,9kb),扩增条件是:

92℃变性 2min
92℃变性 10sec
50℃退火 30sec 10 个循环
60℃延伸 10min
92℃变性 2min
92℃变性 10sec
50℃退火 30sec 20 个循环,每个循环加 10sec
60℃延伸 10min
60℃延伸 10min

就是后20个循环,每个循环加10S,在哪里加呀,PCR仪上能分开两部分吗?为什么第一个10个循环后,还要来一个92度预变性2min。
求高手指点,急呀!
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR程序可以分成几部分的,每个循环加10s也是可以设置。自己摸索一下,或者根据你们实验室PCR的品牌查说明书或者直接找售后人员询问吧。
至于中间还有一个“92度预变性2min”,也许只是作者的习惯而已。。。不过设置起来也不麻烦,没有必要去改一下。
何须剑道争锋?千人指,万人封,可问江湖鼎峰,三尺秋水尘不染,天下无双。
2楼2014-08-31 19:54:34
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guoguo201209

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hongqifei at 2014-08-31 19:54:34
PCR程序可以分成几部分的,每个循环加10s也是可以设置。自己摸索一下,或者根据你们实验室PCR的品牌查说明书或者直接找售后人员询问吧。
至于中间还有一个“92度预变性2min”,也许只是作者的习惯而已。。。不过设 ...

再问一下楼上,每个循环加10S是总共加10S,还是说变性,退火,延伸各加10S呢?不知这是什么原理,和总共30个循环有差别吗?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2014-08-31 23:57:14
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hongqifei

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by guoguo201209 at 2014-08-31 23:57:14
再问一下楼上,每个循环加10S是总共加10S,还是说变性,退火,延伸各加10S呢?不知这是什么原理,和总共30个循环有差别吗?
...

一般只改变退火的条件,在这个例子中就是退火时间加10s,其他不变
何须剑道争锋?千人指,万人封,可问江湖鼎峰,三尺秋水尘不染,天下无双。
4楼2014-09-02 21:26:32
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hongqifei

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by guoguo201209 at 2014-08-31 23:57:14
再问一下楼上,每个循环加10S是总共加10S,还是说变性,退火,延伸各加10S呢?不知这是什么原理,和总共30个循环有差别吗?
...

touchdown PCR倒是做过,每个循环降低退火温度。每个循环延长退火时间的,我也没做过。一般来说,退火时间太短可能会导致引物和模板结合不充分,退火时间增加有利于引物和模板退火,但也增加了模板两条链之间退火的概率。
何须剑道争锋?千人指,万人封,可问江湖鼎峰,三尺秋水尘不染,天下无双。
5楼2014-09-02 21:34:18
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guoguo201209

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by hongqifei at 2014-09-02 21:34:18
touchdown PCR倒是做过,每个循环降低退火温度。每个循环延长退火时间的,我也没做过。一般来说,退火时间太短可能会导致引物和模板结合不充分,退火时间增加有利于引物和模板退火,但也增加了模板两条链之间退火的 ...

感谢楼上的回复,虽然还不明白是怎么回事
6楼2014-09-08 20:42:50
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