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xkzspace

新虫 (初入文坛)

[求助] 求PCR高手来啊!!!! 已有5人参与

小弟得到一个基因,想扩展该基因的CDS序列,老是扩增补出来,求高手指教!
我的基因CDS序列是:ATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCCGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCTGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCAAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATGCCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGACAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCATTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTCTTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGA
信使RNA序列是:
GATTTCTCCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTTCCCACCGCCTCCGCCCTTCGTCGTCGTCGTCGTCGCGCATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCTGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCCGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCGAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATACCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGGCAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCTTTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTATTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGAATGCTAGACAAATTTGATGTCCTCAAATCTGTCCATGGTCTTATGTATATCATCTCTGAAGAACCTGAAAAGTCACAATCTCTGAAGGACATTGCAGCCTTCACTCTTGTACAGATGTCTGTTCCATCTGACATGTGTATCAAGTATTAGACAGAAGGAAAGGGAAACATTGCCATGTACCCAGTAGTCTAACTTATGTCTGTTAATTGGTAAATGTAGTAATGTACTCAACATGTAGGTGTAGTGCATGTCACAAACTTCATTTGATGCATTTCTGGCTCTTGCACTCCTGCTGTCTATGTGTAAAGTTCTGATATTCAGGGTACGTTTGACAAAGCTCCGGATCTTGTCTGGATCAGAAGTTTGTAAGTTAAATCGAAGTGATTTAAAATTGTACATTTCATTTAGAATAGGAACCGAATTATTCATTCAATTGTTACTGACATAATCCCTAATTCAAATCATGGATTTCTGG

CDS位于以上序列的70-1515之间。

由于GC含量特别高,所以我用了很多种酶去扩增,如pfu fly酶,phusion酶,KOD酶,这些高保证的酶都试过了,都无法扩增出目的条带(目的条带大小1446 bp)。请问该怎么扩增这段CDS啊?先谢谢了。。

求PCR高手来啊!!!!
无目的带phusion酶扩增.jpg
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

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★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-22 16:57:46
建议你选择GC-rich PCR Master Mix扩增试试,GC-rich sequence的扩增除了好的酶之外,buffer中的组分很关键,GC-rich buffer中含有能够降低变性温度的添加剂,比较容易扩增出目的条带
rainwater
2楼2014-09-22 16:18:22
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ncuduhan

银虫 (正式写手)

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感谢参与,应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:21
可以试试nest pcr,简单好用~特异性不太好~可以试试gradient,gc含量高不是问题。

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-09-22 23:03:41
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖


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xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:29
GC含量高用GC buffer,再改变退火温度,跟酶没多大关系。
4楼2014-09-23 08:46:25
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xkzspace

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-09-22 23:03:41
可以试试nest pcr,简单好用~特异性不太好~可以试试gradient,gc含量高不是问题。

巢式pcr我扩过,也是扩不出来呀
5楼2014-09-23 12:40:46
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xkzspace

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-09-22 16:18:22
建议你选择GC-rich PCR Master Mix扩增试试,GC-rich sequence的扩增除了好的酶之外,buffer中的组分很关键,GC-rich buffer中含有能够降低变性温度的添加剂,比较容易扩增出目的条带

请问哪家公司可以买到?
6楼2014-09-23 12:42:39
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xkzspace

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-23 08:46:25
GC含量高用GC buffer,再改变退火温度,跟酶没多大关系。

phusion酶里面有5xGC buffer,还是扩不出啊
7楼2014-09-23 12:43:57
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yang0071

木虫 (职业作家)

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xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:40
试试takara的 GC buffer。
然后延长变性的时间,
首次加5min,每次+15s,
退火时间+15s
8楼2014-09-23 13:44:53
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

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xkzspace: 金币+1, how long each stup? 2014-09-25 13:35:44
Just try 2 step
Tm of primer>60
95-->(95, 68)*35-->68-->4
活着就要让人感受到你的存在。
9楼2014-09-23 14:57:02
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)


xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:53
引用回帖:
6楼: Originally posted by xkzspace at 2014-09-23 12:42:39
请问哪家公司可以买到?...

我们刚用过上海生工的GC-rich PCR Master Mix,产品编号为BS9284,扩增过GC%为75%的序列,扩增的效果不错,通过对你的序列分析你的是局部序列GC含量很高,可以先买1 ml试试。
rainwater
10楼2014-09-23 15:45:55
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