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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】减少PCR错配
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】减少PCR错配

我在做PCR时，从电泳结果看貌似有与目的产物相同大小的片段出现，但是怀疑有的是由于错配形成的，经过提高退火温度，减少循环次数后，发现原有的有些片段消失了，可见有的是由于错配引起的假阳性，那么问题是我接下去该如何做才能减小错配发生呢？
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1楼 2011-01-18 15:31:17
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
这个只有用高保真性的酶了,比如 Taqplus！
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2楼2011-01-18 15:36:38
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★ ★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2): 这2个保真酶很不错，强烈推荐~~~ 2011-01-18 21:15:08
xwsooo(金币+1): 2011-01-18 21:23:48
高保真的一般是pfu和kod，taqplus保真性很差，仅强于taq
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3楼2011-01-18 15:41:36
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
消失的片段也可能是你要的片段啊。
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4楼2011-01-18 16:34:00
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翱宇

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
xwsooo(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2): KOD的保真性很好，但是比较贵啊·~~ 2011-01-18 21:14:50
我习惯于用Kod-plus保真性很好，基本上没有错误的。但是有一点需要注意，你的PCR的引物有可能会错，合成的碱基数越多，越容易错。建议测序正确后，进行酶切和链接，而不要通过PCR进行亚克隆！
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5楼2011-01-18 18:43:47
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2011-01-18 16:34:00:
消失的片段也可能是你要的片段啊。

怎么可能。。。不解。。。
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6楼2011-01-18 21:13:01
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-01-18 18:43:47:
我习惯于用Kod-plus保真性很好，基本上没有错误的。但是有一点需要注意，你的PCR的引物有可能会错，合成的碱基数越多，越容易错。建议测序正确后，进行酶切和链接，而不要通过PCR进行亚克隆！

我的上游引物在18bp,下游引物22bp.我的目的序列并没有酶切位点，用的是等位基因PCR...
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7楼2011-01-18 21:14:44
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zhangxn2010

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
克隆基因片段我一直用PFU，貌似很贵，但是值得，测序不会出现错误。
省去了很多麻烦，建议初次做PCR还是摸一下条件（退火温度）
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8楼2011-01-18 21:38:19
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2011-01-18 21:38:19:
克隆基因片段我一直用PFU，貌似很贵，但是值得，测序不会出现错误。
省去了很多麻烦，建议初次做PCR还是摸一下条件（退火温度）

谢谢，我的退火温度已经到了65了，貌似不能再升高了吧。。。
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9楼2011-01-19 11:00:56
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guang012345

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
学长跟我说KOD和LA的还不错
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10楼2011-01-19 17:06:56
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
话说各种Taq都不是高保真酶
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11楼2011-01-19 22:49:44
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傻子

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引物的特异性不够和taq酶是否保真没有关系，用hotstar taq可以减少非特异性扩增
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12楼2011-01-20 14:27:16
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个吗，什么酶也不会完全保真的，减少突变的话，降低循环次数，缩短整个PCR过程的总时间，把PCR系统的扩增效率提高到最大，也就是这些东西。
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13楼2011-01-20 14:48:03
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