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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

[求助] 是否引物发生错配

用一对A的特异引物对作为阴性的B扩增,竟也出现目的条带,不同实验者的结果条带亮度有明显差异,且重复性不是太好。本人对引物设计方面不是太了解,所以能否请大家帮忙看看到底是啥情况呢。将这对引物与B的标准序列做了比较如下,前端引物相关性似乎不大:
P1

P2-RC

另:退火温度为63度,提高温度貌似可以排除干扰。就以上比较而言,是否该对引物对B较易发生非特异扩增?

[ Last edited by lhm_hnyj on 2011-7-19 at 10:06 ]
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tpldtc

金虫 (初入文坛)

主要看5'端和3'端的碱基互补,中间的几个互补不是太长应该没关系的
2楼2011-07-19 10:59:44
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by tpldtc at 2011-07-19 10:59:44:
主要看5'端和3'端的碱基互补,中间的几个互补不是太长应该没关系的

按理不会结合才对是吧,这可如何是好,规定的就用这对引物
3楼2011-07-19 11:20:08
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love_st

金虫 (著名写手)


【答案】应助回帖

lhm_hnyj(金币+2): 2011-07-19 12:39:33
不能排除污染的原因
4楼2011-07-19 12:08:07
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by love_st at 2011-07-19 12:08:07:
不能排除污染的原因

比较郁闷的是,产物测序结果为确为B
5楼2011-07-19 12:41:40
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shuihaizi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

lhm_hnyj(金币+2): 2011-07-20 08:33:41
相似度是满高的(超过14对就有可能很好的结合),为什么引物要设计那么长?A和B是不是同源基因啊?
6楼2011-07-19 19:49:19
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by shuihaizi at 2011-07-19 19:49:19:
相似度是满高的(超过14对就有可能很好的结合),为什么引物要设计那么长?A和B是不是同源基因啊?

谢谢您的解答。14对指单条引物上的相同碱基数吗?不起,实在没这方面的基础,有些知识没法消化。这对引物是别人规定好的,我们必须先用它来验证。A与B为同科不同属的物种。减少引物长度可能改善这一状况对吗?
7楼2011-07-20 08:43:59
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shuihaizi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

lhm_hnyj(金币+5): 2011-07-21 10:54:26
我们做普通的PCR是这样的,14对就可以了,能后特异性结合,所以你的因物种匹配的碱基很多,自然就容易产生错配了(与B结合)。既然AB都不是一个物种,那为什么两者都能扩增出来呢?你的样品是混杂的(包括两个物种)?如果A的序列是已知的,那么就可以重新设计引物,尽量减少和B的特异性,就可以了。否则按现在的设计,是不可能排除.除非你的这对引物有特殊的用途,因为我不了解你的实验背景,只是参考建议。
8楼2011-07-20 17:58:51
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by shuihaizi at 2011-07-20 17:58:51:
我们做普通的PCR是这样的,14对就可以了,能后特异性结合,所以你的因物种匹配的碱基很多,自然就容易产生错配了(与B结合)。既然AB都不是一个物种,那为什么两者都能扩增出来呢?你的样品是混杂的(包括两个物种 ...

谢谢,看来的确是引物设计不合理,准备改进
9楼2011-07-21 10:57:11
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