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lhm_hnyj

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[求助] 是否引物发生错配

用一对A的特异引物对作为阴性的B扩增，竟也出现目的条带，不同实验者的结果条带亮度有明显差异，且重复性不是太好。本人对引物设计方面不是太了解，所以能否请大家帮忙看看到底是啥情况呢。将这对引物与B的标准序列做了比较如下，前端引物相关性似乎不大：
P1

P2-RC

另：退火温度为63度，提高温度貌似可以排除干扰。就以上比较而言，是否该对引物对B较易发生非特异扩增？

[ Last edited by lhm_hnyj on 2011-7-19 at 10:06 ]

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1楼2011-07-19 09:54:24

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shuihaizi

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

lhm_hnyj(金币+5): 2011-07-21 10:54:26

我们做普通的PCR是这样的，14对就可以了，能后特异性结合，所以你的因物种匹配的碱基很多，自然就容易产生错配了（与B结合）。既然AB都不是一个物种，那为什么两者都能扩增出来呢？你的样品是混杂的（包括两个物种）？如果A的序列是已知的，那么就可以重新设计引物，尽量减少和B的特异性，就可以了。否则按现在的设计，是不可能排除.除非你的这对引物有特殊的用途，因为我不了解你的实验背景，只是参考建议。