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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】减少PCR错配
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xwsooo

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】减少PCR错配

我在做PCR时，从电泳结果看貌似有与目的产物相同大小的片段出现，但是怀疑有的是由于错配形成的，经过提高退火温度，减少循环次数后，发现原有的有些片段消失了，可见有的是由于错配引起的假阳性，那么问题是我接下去该如何做才能减小错配发生呢？
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1楼 2011-01-18 15:31:17
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2011-01-18 16:34:00:
消失的片段也可能是你要的片段啊。

怎么可能。。。不解。。。
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6楼2011-01-18 21:13:01
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 翱宇 at 2011-01-18 18:43:47:
我习惯于用Kod-plus保真性很好，基本上没有错误的。但是有一点需要注意，你的PCR的引物有可能会错，合成的碱基数越多，越容易错。建议测序正确后，进行酶切和链接，而不要通过PCR进行亚克隆！

我的上游引物在18bp,下游引物22bp.我的目的序列并没有酶切位点，用的是等位基因PCR...
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7楼2011-01-18 21:14:44
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xwsooo

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhangxn2010 at 2011-01-18 21:38:19:
克隆基因片段我一直用PFU，貌似很贵，但是值得，测序不会出现错误。
省去了很多麻烦，建议初次做PCR还是摸一下条件（退火温度）

谢谢，我的退火温度已经到了65了，貌似不能再升高了吧。。。
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9楼2011-01-19 11:00:56
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