应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求PCR高手来啊！！！！
汕头大学海洋科学接受调剂
151/2返回列表12下一页
查看: 1591  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xkzspace

新虫 (初入文坛)

[求助] 求PCR高手来啊！！！！ 已有5人参与

小弟得到一个基因，想扩展该基因的CDS序列，老是扩增补出来，求高手指教！
我的基因CDS序列是：ATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCCGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCTGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCAAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATGCCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGACAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCATTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTCTTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGA
信使RNA序列是：
GATTTCTCCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTTCCCACCGCCTCCGCCCTTCGTCGTCGTCGTCGTCGCGCATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCTGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCCGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCGAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATACCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGGCAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCTTTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTATTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGAATGCTAGACAAATTTGATGTCCTCAAATCTGTCCATGGTCTTATGTATATCATCTCTGAAGAACCTGAAAAGTCACAATCTCTGAAGGACATTGCAGCCTTCACTCTTGTACAGATGTCTGTTCCATCTGACATGTGTATCAAGTATTAGACAGAAGGAAAGGGAAACATTGCCATGTACCCAGTAGTCTAACTTATGTCTGTTAATTGGTAAATGTAGTAATGTACTCAACATGTAGGTGTAGTGCATGTCACAAACTTCATTTGATGCATTTCTGGCTCTTGCACTCCTGCTGTCTATGTGTAAAGTTCTGATATTCAGGGTACGTTTGACAAAGCTCCGGATCTTGTCTGGATCAGAAGTTTGTAAGTTAAATCGAAGTGATTTAAAATTGTACATTTCATTTAGAATAGGAACCGAATTATTCATTCAATTGTTACTGACATAATCCCTAATTCAAATCATGGATTTCTGG

CDS位于以上序列的70-1515之间。

由于GC含量特别高，所以我用了很多种酶去扩增，如pfu fly酶，phusion酶，KOD酶，这些高保证的酶都试过了，都无法扩增出目的条带（目的条带大小1446 bp）。请问该怎么扩增这段CDS啊？先谢谢了。。

求PCR高手来啊！！！！
无目的带phusion酶扩增.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-09-22 15:41:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-22 16:57:46
建议你选择GC-rich PCR Master Mix扩增试试，GC-rich sequence的扩增除了好的酶之外，buffer中的组分很关键，GC-rich buffer中含有能够降低变性温度的添加剂，比较容易扩增出目的条带
赞一下 回复此楼
rainwater
2楼2014-09-22 16:18:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:21
可以试试nest pcr，简单好用～特异性不太好～可以试试gradient，gc含量高不是问题。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2014-09-22 23:03:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:29
GC含量高用GC buffer，再改变退火温度，跟酶没多大关系。
赞一下 回复此楼
4楼2014-09-23 08:46:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xkzspace

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-09-22 23:03:41
可以试试nest pcr，简单好用～特异性不太好～可以试试gradient，gc含量高不是问题。

巢式pcr我扩过，也是扩不出来呀
赞一下 回复此楼
5楼2014-09-23 12:40:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xkzspace

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-09-22 16:18:22
建议你选择GC-rich PCR Master Mix扩增试试，GC-rich sequence的扩增除了好的酶之外，buffer中的组分很关键，GC-rich buffer中含有能够降低变性温度的添加剂，比较容易扩增出目的条带

请问哪家公司可以买到？
赞一下 回复此楼
6楼2014-09-23 12:42:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xkzspace

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-23 08:46:25
GC含量高用GC buffer，再改变退火温度，跟酶没多大关系。

phusion酶里面有5xGC buffer，还是扩不出啊
赞一下 回复此楼
7楼2014-09-23 12:43:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:40
试试takara的 GC buffer。
然后延长变性的时间，
首次加5min，每次+15s，
退火时间+15s
赞一下 回复此楼
8楼2014-09-23 13:44:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace: 金币+1, how long each stup？ 2014-09-25 13:35:44
Just try 2 step
Tm of primer>60
95-->(95, 68)*35-->68-->4
赞一下 回复此楼
活着就要让人感受到你的存在。
9楼2014-09-23 14:57:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)
★
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:53
引用回帖:
6楼: Originally posted by xkzspace at 2014-09-23 12:42:39
请问哪家公司可以买到？...

我们刚用过上海生工的GC-rich PCR Master Mix，产品编号为BS9284，扩增过GC%为75%的序列，扩增的效果不错，通过对你的序列分析你的是局部序列GC含量很高，可以先买1 ml试试。
赞一下 回复此楼
rainwater
10楼2014-09-23 15:45:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xkzspace 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 调剂求收留 +33 果然有我 2026-04-10 34/1700 2026-04-15 00:37 by zzzggc
[考研] 085400电子信息类（川大控制工程）求调剂可跨专业 求老师联系 +6 626776879 2026-04-08 6/300 2026-04-14 20:09 by gwjxiaolang
[考研] 271求调剂 +35 2261744733 2026-04-11 41/2050 2026-04-14 15:36 by zs92450
[考研] 085801电气专硕272求调剂 +14 电气李 2026-04-13 15/750 2026-04-14 14:58 by 逆水乘风
[考研] 求调剂 +16 雪逢冬 2026-04-10 16/800 2026-04-14 14:27 by 逆水乘风
[考研] 考研求调剂 +6 ban班小七 2026-04-11 6/300 2026-04-14 14:06 by 哆啦A梦只是个梦
[考研] 求调剂 +3 我爱高数高数爱� 2026-04-12 3/150 2026-04-14 01:00 by 王珺璞
[考研] 一志愿华工085600 331分 +7 天下ww 2026-04-09 7/350 2026-04-13 09:01 by lhj2009
[考研] 346分，工科0854求调剂，专硕 +6 moser233 2026-04-12 7/350 2026-04-12 22:11 by fqwang
[考研] 296求调剂 +14 汪！？！ 2026-04-10 16/800 2026-04-12 10:48 by zhouyuwinner
[考研] 086003调剂求助 +21 苏弋万 2026-04-09 22/1100 2026-04-11 20:25 by dongdian1
[考研] 296求调剂 +6 汪！？！ 2026-04-09 6/300 2026-04-11 11:25 by zhq0425
[考研] 22408 352分求调剂0854类 +4 努力的夏末 2026-04-09 4/200 2026-04-11 09:57 by zhq0425
[考研] 085402通信工程调剂，有4项学科竞赛国奖（电赛国二），硕士研究生调剂自荐信。 +5 m永o不v言o弃m 2026-04-09 5/250 2026-04-11 09:33 by zhq0425
[考研] 一志愿矿大，材料工程专硕314分，0856可调都可以 +15 无懈可击的巨人 2026-04-09 15/750 2026-04-10 18:10 by hmn_wj
[考研] 085800 能源动力求调剂 +6 阿biu啊啊啊啊啊 2026-04-10 6/300 2026-04-10 15:03 by hemengdong
[考研] 085601初试330分找调剂 +10 流心奶黄包l 2026-04-09 10/500 2026-04-10 08:14 by Sammy2
[考研] 283电子信息求调剂 +4 三石WL 2026-04-08 4/200 2026-04-09 10:21 by wp06
[考研] 286求调剂 +19 Faune 2026-04-08 20/1000 2026-04-09 08:36 by 哦哦123
[考研] 085404，334分，求调剂 +5 sunjie8888 2026-04-08 8/400 2026-04-09 07:26 by sunjie8888
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭