应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求PCR高手来啊！！！！
151/2返回列表12下一页
查看: 1820  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xkzspace

新虫 (初入文坛)

[求助] 求PCR高手来啊！！！！ 已有5人参与

小弟得到一个基因，想扩展该基因的CDS序列，老是扩增补出来，求高手指教！
我的基因CDS序列是：ATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCCGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCTGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCAAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATGCCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGACAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCATTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTCTTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGA
信使RNA序列是：
GATTTCTCCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTTCCCACCGCCTCCGCCCTTCGTCGTCGTCGTCGTCGCGCATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCTGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCCGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCGAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATACCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGGCAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCTTTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTATTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGAATGCTAGACAAATTTGATGTCCTCAAATCTGTCCATGGTCTTATGTATATCATCTCTGAAGAACCTGAAAAGTCACAATCTCTGAAGGACATTGCAGCCTTCACTCTTGTACAGATGTCTGTTCCATCTGACATGTGTATCAAGTATTAGACAGAAGGAAAGGGAAACATTGCCATGTACCCAGTAGTCTAACTTATGTCTGTTAATTGGTAAATGTAGTAATGTACTCAACATGTAGGTGTAGTGCATGTCACAAACTTCATTTGATGCATTTCTGGCTCTTGCACTCCTGCTGTCTATGTGTAAAGTTCTGATATTCAGGGTACGTTTGACAAAGCTCCGGATCTTGTCTGGATCAGAAGTTTGTAAGTTAAATCGAAGTGATTTAAAATTGTACATTTCATTTAGAATAGGAACCGAATTATTCATTCAATTGTTACTGACATAATCCCTAATTCAAATCATGGATTTCTGG

CDS位于以上序列的70-1515之间。

由于GC含量特别高，所以我用了很多种酶去扩增，如pfu fly酶，phusion酶，KOD酶，这些高保证的酶都试过了，都无法扩增出目的条带（目的条带大小1446 bp）。请问该怎么扩增这段CDS啊？先谢谢了。。

求PCR高手来啊！！！！
无目的带phusion酶扩增.jpg
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2014-09-22 15:41:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-22 16:57:46
建议你选择GC-rich PCR Master Mix扩增试试，GC-rich sequence的扩增除了好的酶之外，buffer中的组分很关键，GC-rich buffer中含有能够降低变性温度的添加剂，比较容易扩增出目的条带
赞一下 回复此楼
rainwater
2楼2014-09-22 16:18:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ncuduhan

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:21
可以试试nest pcr，简单好用～特异性不太好～可以试试gradient，gc含量高不是问题。

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
3楼2014-09-22 23:03:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:29
GC含量高用GC buffer，再改变退火温度，跟酶没多大关系。
赞一下 回复此楼
4楼2014-09-23 08:46:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xkzspace

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ncuduhan at 2014-09-22 23:03:41
可以试试nest pcr，简单好用～特异性不太好～可以试试gradient，gc含量高不是问题。

巢式pcr我扩过，也是扩不出来呀
赞一下 回复此楼
5楼2014-09-23 12:40:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xkzspace

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-09-22 16:18:22
建议你选择GC-rich PCR Master Mix扩增试试，GC-rich sequence的扩增除了好的酶之外，buffer中的组分很关键，GC-rich buffer中含有能够降低变性温度的添加剂，比较容易扩增出目的条带

请问哪家公司可以买到？
赞一下 回复此楼
6楼2014-09-23 12:42:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xkzspace

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-23 08:46:25
GC含量高用GC buffer，再改变退火温度，跟酶没多大关系。

phusion酶里面有5xGC buffer，还是扩不出啊
赞一下 回复此楼
7楼2014-09-23 12:43:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yang0071

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:40
试试takara的 GC buffer。
然后延长变性的时间，
首次加5min，每次+15s，
退火时间+15s
赞一下 回复此楼
8楼2014-09-23 13:44:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xkzspace: 金币+1, how long each stup？ 2014-09-25 13:35:44
Just try 2 step
Tm of primer>60
95-->(95, 68)*35-->68-->4
赞一下 回复此楼
活着就要让人感受到你的存在。
9楼2014-09-23 14:57:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)
★
xkzspace(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:45:53
引用回帖:
6楼: Originally posted by xkzspace at 2014-09-23 12:42:39
请问哪家公司可以买到？...

我们刚用过上海生工的GC-rich PCR Master Mix，产品编号为BS9284，扩增过GC%为75%的序列，扩增的效果不错，通过对你的序列分析你的是局部序列GC含量很高，可以先买1 ml试试。
赞一下 回复此楼
rainwater
10楼2014-09-23 15:45:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xkzspace 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-28 16:06 by winsaint
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +4 gdd2018 2026-08-28 9/450 2026-08-28 14:22 by jklily
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +3 bud_bud 2026-08-27 6/300 2026-08-28 11:53 by bud_bud
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+5) +12 晴天加油 2026-08-26 13/650 2026-08-28 11:32 by skyjudy
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +22 羊腰板 2026-08-21 25/1250 2026-08-26 15:00 by zuocuiping
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[职场人生] 学生撞见辅导员送外卖，第二天全班都沉默了 +3 鲸鱼融金_浙江_� 2026-08-22 3/150 2026-08-26 09:01 by zzuzxg
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭