| 查看: 2213 | 回复: 6 | ||
[求助]
求助引物设计和载体构建问题 已有1人参与
|
|
大家好，我获得了一个侯选的目的基因，要扩它的CDS，但是扩了好多此都没办法扩出来，请给位大哥大姐们支支招啊，不胜感谢！ 我的获选基因的CDS序列如下： ATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCCGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCTGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCAAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATGCCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGACAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCATTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTCTTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGA BLAST后有非编码区的基因如下： GATTTCTCCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTTCCCACCGCCTCCGCCCTTCGTCGTCGTCGTCGTCGCGCATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCTGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCCGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCGAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATACCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGGCAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCTTTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTATTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGAATGCTAGACAAATTTGATGTCCTCAAATCTGTCCATGGTCTTATGTATATCATCTCTGAAGAACCTGAAAAGTCACAATCTCTGAAGGACATTGCAGCCTTCACTCTTGTACAGATGTCTGTTCCATCTGACATGTGTATCAAGTATTAGACAGAAGGAAAGGGAAACATTGCCATGTACCCAGTAGTCTAACTTATGTCTGTTAATTGGTAAATGTAGTAATGTACTCAACATGTAGGTGTAGTGCATGTCACAAACTTCATTTGATGCATTTCTGGCTCTTGCACTCCTGCTGTCTATGTGTAAAGTTCTGATATTCAGGGTACGTTTGACAAAGCTCCGGATCTTGTCTGGATCAGAAGTTTGTAAGTTAAATCGAAGTGATTTAAAATTGTACATTTCATTTAGAATAGGAACCGAATTATTCATTCAATTGTTACTGACATAATCCCTAATTCAAATCATGGATTTCTGG CDS位于以上序列的70-1515之间。 我之前设计了2次引物，用普通的酶，pfu FLY酶，KOD酶都试了一次，都没有扩增出我要的目的条带。我该怎么再扩这个基因啊？求各位指点，最好能帮我再试试设计一对引物或分析一下怎么扩增它。 还有一个问题就是我要用上面的CDS连接到载体p1302上面的绿色位置去，该怎么设计？载体图如下。谢谢。  p1302.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
科研人必读：新一代 KRAS G12C 抑制剂 Olomorasib 的研究进展
已经有0人回复
-
BT-11（Omilancor）研究化合物全解析：从分子结构到实验应用要点
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有109人回复
-
富马酸贝达喹啉：二芳基喹啉类工具化合物的化学特征
已经有0人回复
-
BT投稿with editor状态快两周了，正常吗
已经有25人回复
-
Silevertinib（BDTX-1535）结构拆解：炔基双环片段为何成为合成瓶颈
已经有0人回复
-
RO4929097 解析：双苯并氮杂䓬骨架与 Notch 通路实验设计要点
已经有0人回复
-
分子量 1157 的 PROTAC 怎么配不析出：SGK3-PROTAC1 的溶解、分装与图谱复核
已经有0人回复
-
logP 6.1 的羧酸怎么配母液：GSK 650394 的溶解窗口与稀释顺序
已经有0人回复
-
从"水不溶"到 71 mg/mL：雷特格韦的 pH 依赖溶解与螯合色谱边界
已经有0人回复
-
133 Ų 的极性表面积，如何决定 TNG462 的母液配制与色谱条件
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求教DNA上下游引物设计的疑问
已经有13人回复
- 求助在载体构建过程中，信号肽与GFP的引物设计、启动子切除以及读码框的问题
已经有3人回复
- 求助怎么设计这样的引物
已经有19人回复
- PGEX-6P-1 载体构建 求帮忙
已经有10人回复
- 设计引物装载体 求高手
已经有7人回复
- 引物设计时酶切位点的添加。
已经有4人回复
- 求助全序列基因扩增引物怎么设计啊
已经有5人回复
- 引物设计 基因全长的获得
已经有13人回复
- 人类基因组DNA引物设计问题
已经有7人回复
- 请教不知道质粒信息的情况下，怎样设计引物来进行测序
已经有7人回复
- 求助设计引物时酶切位点保护碱基的问题
已经有19人回复
- 设计引物注意事项？
已经有6人回复
- 问问pet-28a克隆构建引物的问题
已经有12人回复
- 载体构建技术请教，如何设计引物提取基因插入载体中？
已经有3人回复
- 全质粒PCR引物设计
已经有9人回复
- 关于PCR引物设计及添加酶切位点和保护碱基的问题
已经有4人回复
- 引物设计的问题
已经有6人回复
- 已经带his标签目的蛋白基因如何设计引物啊（目的基因已经接在pET-22b的载体上了）
已经有8人回复
- 做蛋白体外表达时的引物设计问题！
已经有12人回复
- 【求助/交流】紧急求助~~ 关于简并引物设计 codehop 和genefisher 在线
已经有12人回复
- 【求助/交流】构建GUS载体的问题
已经有8人回复
- 【求助/交流】引物设计的 序列选择问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】PMD 19 质粒载体 引物 m13 特异性问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】同尾酶构建载体问题
已经有6人回复
- 急求：构建载体时引物设计的问题
已经有7人回复
|
本帖内容被屏蔽 |
2楼2014-09-11 20:19:26
3楼2014-09-11 21:02:37
DoctorWatson
铜虫 (小有名气)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 139.7
- 红花: 1
- 帖子: 92
- 在线: 24小时
- 虫号: 2252382
- 注册: 2013-01-21
- 性别: GG
- 专业: 心肌细胞/血管细胞损伤、修
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
意萧02(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-12 10:42:38
意萧02: 金币+3, ★有帮助 2014-11-14 14:37:58
意萧02: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-11-27 17:43:52
感谢参与，应助指数 +1
意萧02(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-12 10:42:38
意萧02: 金币+3, ★有帮助 2014-11-14 14:37:58
意萧02: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-11-27 17:43:52
|
看你的说法，你是要扩增全长片段，做分子克隆，制作真核表达载体什么的。 首先你要扩出来，PCR之后胶回收。maker能跑出来吗？ PCR不成功，试试梯度PCR,也就是说换温度。 其次，你的引物设计如何，是不是在CDS之外。另外普通的酶可能错配率较高，建议使用高保真酶或者pfu. 另外，你应该有能跑小片段的引物，试试普通的taq酶看看到底是否存在表达。 |
4楼2014-09-11 21:53:28
5楼2014-09-12 08:51:00
DoctorWatson
铜虫 (小有名气)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 139.7
- 红花: 1
- 帖子: 92
- 在线: 24小时
- 虫号: 2252382
- 注册: 2013-01-21
- 性别: GG
- 专业: 心肌细胞/血管细胞损伤、修
6楼2014-09-12 11:51:45
7楼2019-06-27 22:09:17
