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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸杂交 » 求助引物设计和载体构建问题
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意萧02

木虫 (正式写手)

[求助] 求助引物设计和载体构建问题 已有1人参与

大家好，我获得了一个侯选的目的基因，要扩它的CDS，但是扩了好多此都没办法扩出来，请给位大哥大姐们支支招啊，不胜感谢！
我的获选基因的CDS序列如下：
ATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCCGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCTGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCAAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATGCCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGACAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCATTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTCTTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGA
BLAST后有非编码区的基因如下：

GATTTCTCCTCCCCTCCCCTCCCCTCCCCTTCCCACCGCCTCCGCCCTTCGTCGTCGTCGTCGTCGCGCATGGAGTCACCCGCCGCGGGCGGCGCGTCTCCGGCGCCGGAGGCTCCTCCGCCCCCGCCGAGGGGGTGGATCTCCGGCCTCGTCTCCGGAGCCGGCCGGATCCTCGCCTCCGTGCTAGGTCCCGACTCGCCTGCCGCCGCCTCCGGCTCCGCCACGACGACCTCAGCCACGTCGCCGTCCGCGTCCTCCTCCCCGGCGTCGTCCAGGCATCCCGGTTATATTCGAGATCATGGTAATTCCCCACTATTTTTTCCGAAAGCTAATAAGTTAAACAAGAGTGAAAATGAAGCAATTATGAAAGATTATTCTGAGGCATCACTAGCAATTATCTCAGAGATTGAGCCGAAGGATGCCATAATGCAGTTACTTAAGCAGGAGACTTATTCAAGGTCTGAATGCAATGCACTAGTAAAGATAATTCAAGAGCGGGTTGTGGACTCAAATTTAAATGGAGTTGATGCTGGTGGGCTTGCTCTTCCAATCAATTGGAAGACTGGCAGACAAGCAAATATTGGATATTCTTCATTGAGTCCAAAAGGATTGTTGCCTGCAACTTCAATTCCTCCAGTCCAGGACCATGTTTTTGATAATAGTGCTGGTGCCGGTGCATCTACAACAATAGCTCATGATAGGGGTCCTTTCGCCCACGCTACTGATAAGATTCAATCCGTACTCAAAAGAAGTTGCTCTGTTGCAACGGATACCCCTGACCCTGAGGACTCCCGAAGAGTCAGGCCAAAAATTAATGGAAATTCATTAGAAATTTCAAATTTTAAGCAAGTCGATGTTATTCGAACTCATTCAGGAGATGACAATAAATTATCAGATGTTCCCCTTTTTGGGACCAACAATTTAATATATTCTAATATTGTTTCAATTGTTGGGAGTGCCGATGAAAAAATAGGCATACCTAACAAACCTTCAGCTGGTGATGGCAATAAAAACTATGATTCTGAATTTTTAAATCCATGTACCAATAAGGATCTGAAGAACAGCTTTCCATTGAAGGTGGAACCTTTGGATGTTTGTATTCCTTTCGAGCAGCAGATGATGGATCTCTCACACCAGAAGCATGAGCATGCTGCATGTGATGATTATTGTTCTGTCTCAAAATTAATGTTTAAGGAGGATATTGAGACTGCACTCAGCATGCCAGTGGGCGTGCCGCTAGAAAATGGTTCTAAGAACCGGAGACGAAGGGCACCCAACACGCAGAGGATTACCCCGGCAAGGTCTCCTGCCAAGGGTTCACGTCGCAAGAGTAATGATGTCACAGTAAAATCAGAGACCGACTTGCTAGAGCAAAGCAAGGGTTCACATGATGTCACAGTAAAGTCAGAGATCGACTTGCTAGAGCAAAGTAAATTGGCACTGATGGAGCAGTCACCAGATTTAGGCGATATTCCGGTGAAGAGACCAGTTGGGAGGCCAAGGAAGGCAAAATGAATGCTAGACAAATTTGATGTCCTCAAATCTGTCCATGGTCTTATGTATATCATCTCTGAAGAACCTGAAAAGTCACAATCTCTGAAGGACATTGCAGCCTTCACTCTTGTACAGATGTCTGTTCCATCTGACATGTGTATCAAGTATTAGACAGAAGGAAAGGGAAACATTGCCATGTACCCAGTAGTCTAACTTATGTCTGTTAATTGGTAAATGTAGTAATGTACTCAACATGTAGGTGTAGTGCATGTCACAAACTTCATTTGATGCATTTCTGGCTCTTGCACTCCTGCTGTCTATGTGTAAAGTTCTGATATTCAGGGTACGTTTGACAAAGCTCCGGATCTTGTCTGGATCAGAAGTTTGTAAGTTAAATCGAAGTGATTTAAAATTGTACATTTCATTTAGAATAGGAACCGAATTATTCATTCAATTGTTACTGACATAATCCCTAATTCAAATCATGGATTTCTGG

CDS位于以上序列的70-1515之间。
我之前设计了2次引物，用普通的酶，pfu FLY酶，KOD酶都试了一次，都没有扩增出我要的目的条带。我该怎么再扩这个基因啊？求各位指点，最好能帮我再试试设计一对引物或分析一下怎么扩增它。
还有一个问题就是我要用上面的CDS连接到载体p1302上面的绿色位置去，该怎么设计？载体图如下。谢谢。

求助引物设计和载体构建问题
p1302.jpg
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1楼 2014-09-11 17:47:27
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bolysu

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
2楼2014-09-11 20:19:26
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意萧02

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bolysu at 2014-09-11 20:19:26
这么简单的问题，随便找个师兄师姐问下全知道了

求赐教！
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3楼2014-09-11 21:02:37
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DoctorWatson

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
意萧02(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-12 10:42:38
意萧02: 金币+3, ★有帮助 2014-11-14 14:37:58
意萧02: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-11-27 17:43:52
看你的说法，你是要扩增全长片段，做分子克隆，制作真核表达载体什么的。
首先你要扩出来，PCR之后胶回收。maker能跑出来吗？
PCR不成功，试试梯度PCR,也就是说换温度。
其次，你的引物设计如何，是不是在CDS之外。另外普通的酶可能错配率较高，建议使用高保真酶或者pfu.
另外，你应该有能跑小片段的引物，试试普通的taq酶看看到底是否存在表达。
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4楼2014-09-11 21:53:28
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意萧02

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by DoctorWatson at 2014-09-11 21:53:28
看你的说法，你是要扩增全长片段，做分子克隆，制作真核表达载体什么的。
首先你要扩出来，PCR之后胶回收。maker能跑出来吗？
PCR不成功，试试梯度PCR,也就是说换温度。
其次，你的引物设计如何，是不是在CDS之外 ...

扩出来后条带有很多，在目的条带大小出有一个条带，所有我做了胶回收，但是纯化后的DNA去再扩一次，目的条带就没了，变成好多小条带，marker跑的正常。
pcr我做过梯度了。
引物设计是在CDS之外，用了高保真的pfu，KOD都是扩不到目的带（如上所说）；
最后一点是什么意思？没看明白啊。谢谢
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5楼2014-09-12 08:51:00
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DoctorWatson

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-09-12 08:51:00
扩出来后条带有很多，在目的条带大小出有一个条带，所有我做了胶回收，但是纯化后的DNA去再扩一次，目的条带就没了，变成好多小条带，marker跑的正常。
pcr我做过梯度了。
引物设计是在CDS之外，用了高保真的pfu ...

那可能存在一些问题。具体我很难说，如果借酶方便的话，借别人的酶做一次。胶回收的产物可以直接跑，多加点样，一般可以直接跑出条带。
最后一个的意思是是非全长引物，就是普通pcr，跑中间一两百bp的那种鉴定引物。
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6楼2014-09-12 11:51:45
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匿名

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7楼2019-06-27 22:09:17
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