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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切经验分享
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clark2010

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切经验分享 已有1人参与

前段时间做了双酶切后连接，载体7.5 Kb （小片段只有300 bp）， 连接用片段是从T载体上切下来的，分别是1 Kb，1.5 Kb，和2 Kb，fermentas的fast酶，切了15min后胶回收，连接转化之后挑单菌验证，各挑两个转化子，结果发现只有1 Kb的片段连上了，其余4个都是载体自连。

第二次做的时候两个酶的用量都减半，然后将反应时间延长到1 h，最后挑了6个转化子，验证全部正确。

个人认为可能的原因：
在说明书上写了酶的用量加起来不能超过总体积的1/10，而两个都按20 uL体系加1 uL酶的话，如果枪尖沾点甘油，打进去就超过1/10了，可能会影响某些酶的效率，酶的用量减半可以解决这个问题。而延长反应时间可以弥补酶量不足的问题，所以可以得到比较好的结果。

个人意见，请大家讨论。
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1楼 2014-09-09 00:38:53
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潘潘0227

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好，一般双酶切会切不完全，两次单酶切回收效率不高，怎么破？

发自小木虫IOS客户端
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2楼2015-10-31 20:20:05
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clark2010

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 潘潘0227 at 2015-10-31 20:20:05
你好，一般双酶切会切不完全，两次单酶切回收效率不高，怎么破？

个人觉得，首先可以延长反应时间。
或者，即使酶切不完全，单酶切和双酶切的片段跑胶总是能分开的吧，加大酶切反应体系，切胶回收的时候回收双酶切那个片段就行，回收完之后洗脱的水别加太多，DNA浓度会高一些。
如果分不开，酶切的同时将载体去磷酸化，可以防止自连，这样，连接你的目的片段之后，筛选到杨兴克隆的几率也大一些。
最后，注意一下，测一下DNA浓度，酶切的时候DNA别加太多了，太多了会切不完全的。具体用量，请参考你所用的内切酶的说明书。
暂时能想到的就这么多了。
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3楼2015-11-01 04:51:36
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