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clark2010

金虫 (小有名气)

[交流] 双酶切经验分享 已有1人参与

前段时间做了双酶切后连接,载体7.5 Kb (小片段只有300 bp), 连接用片段是从T载体上切下来的,分别是1 Kb,1.5 Kb,和2 Kb,fermentas的fast酶,切了15min后胶回收,连接转化之后挑单菌验证,各挑两个转化子,结果发现只有1 Kb的片段连上了,其余4个都是载体自连。

第二次做的时候两个酶的用量都减半,然后将反应时间延长到1 h,最后挑了6个转化子,验证全部正确。

个人认为可能的原因:
在说明书上写了酶的用量加起来不能超过总体积的1/10,而两个都按20 uL体系加1 uL酶的话,如果枪尖沾点甘油,打进去就超过1/10了,可能会影响某些酶的效率,酶的用量减半可以解决这个问题。而延长反应时间可以弥补酶量不足的问题,所以可以得到比较好的结果。

个人意见,请大家讨论。
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clark2010

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 潘潘0227 at 2015-10-31 20:20:05
你好,一般双酶切会切不完全,两次单酶切回收效率不高,怎么破?

个人觉得,首先可以延长反应时间。
或者,即使酶切不完全,单酶切和双酶切的片段跑胶总是能分开的吧,加大酶切反应体系,切胶回收的时候回收双酶切那个片段就行,回收完之后洗脱的水别加太多,DNA浓度会高一些。
如果分不开,酶切的同时将载体去磷酸化,可以防止自连,这样,连接你的目的片段之后,筛选到杨兴克隆的几率也大一些。
最后,注意一下,测一下DNA浓度,酶切的时候DNA别加太多了,太多了会切不完全的。具体用量,请参考你所用的内切酶的说明书。
暂时能想到的就这么多了。
3楼2015-11-01 04:51:36
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潘潘0227

铜虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你好,一般双酶切会切不完全,两次单酶切回收效率不高,怎么破?

发自小木虫IOS客户端
2楼2015-10-31 20:20:05
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